Il corso si propone di fornire agli studenti una panoramica sulle principali strategie per la produzione di proteine ricombinanti in E. coli prendendo in esame nello specifico le varie problematiche connesse all'espressione, estrazione e purificazione dei prodotti ricombinanti. Saranno inoltre trattati approfonditamente i principi delle tecniche analitiche che verranno utilizzate dagli studenti durante le lezioni di laboratorio.

Tecniche elettroforetiche per l'analisi di proteine

Proprietà ioniche di aminoacidi e proteine

Aspetti fisici della separazione elettroforetica

Gel di poliacrilammide

SDS-PAGE

Sistema gel/tampone di tipo discontinuo

Metodi di colorazione

Western blotting

Immunoblotting

PAGE in condizioni native

EMSA

Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine

Assorbimento a 280 nm

Metodo Bradford

Metodo Lowry

E. coli come sistema di espressione

Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti

Caratteristiche di un sistema di espressione

Vettori di espressione plasmidici

Sito multiplo di clonaggio e codon usage

Origine di replicazione e copie plasmidiche

I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, PL,T7)

I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi

Il Ribosome Binding Site

Strategie per prevenire la proteolisi in vivo

Proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare

Manipolazione delle condizioni di fermentazione

Ingegnerizzazione dell’ospite

Ingegnerizzazione del prodotto

Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione

Folding delle proteine e formazione dei corpi di inclusione

Manipolazione delle condizioni di fermentazione

Ingegnerizzazione dell’ospite

I ceppi “ossidanti”

Co-espressione con chaperon molecolari

Ingegnerizzazione del prodotto

La secrezione nel periplasma

Le proteine di fusione (MBP, GST, SUMO)

I tag di fusione e il tagging combinatoriale

Preparazione di un lisato batterico e tecniche di frazionamento iniziale

Crioconservazione della biomassa

Metodi di rottura delle cellule batteriche

Componenti del tampone di estrazione

Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione

Solubilizzazione delle proteine dai corpi di inclusione

Metodi di refolding in vitro

Sviluppo di un protocollo di purificazione

Chiarificazione dell’estratto

Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione

Sviluppo di un saggio specifico

Selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento

Resa e grado di purificazione

La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione

La matrice

Il ligando

Il braccio spaziatore

Tecniche di eluizione

Caratterizzazione del prodotto proteico

Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche

Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici

  Test del coniglio

  Test LAL (gel clot, cromogenico, turbidimetrico, ricombinante)

  Test di rilascio delle citochine

Tecniche di eliminazione di contaminanti endotossinici

Espressione e purificazione di una proteina ricombinante: dalla teoria alla pratica di laboratorio

Preparazione delle soluzioni per SDS-PAGE e allestimento gel

Determinazione della retta di calibrazione di BSA e IgG con metodo Bradford

Terreni e soluzioni per la crescita batterica

Tamponi per l’estrazione di proteine solubili e insolubili

Crescita batterica e induzione

Rottura delle cellule ed estrazione delle proteine

Analisi SDS-PAGE degli indotti

Purificazione della proteina ricombinante tramite cromatografia di affinità

Analisi SDS-PAGE delle frazioni cromatografiche

Test LAL, metodica gel clot

Modalità didattiche

Lezioni frontali e in laboratorio

Obblighi

Per poter sostenere l’esame è obbligatorio seguire almeno due terzi delle ore di lezione in laboratorio.

Sono dispensati dal seguire le lezioni in laboratorio coloro che già operano in laboratori di ricerca presso strutture sanitarie o enti di ricerca. L’esenzione prevede la presentazione di certificazione attestante l’attività svolta a cura del datore di lavoro. In questo caso, per potere sostenere l’esame orale è comunque obbligatorio superare una prova pratica diretta ad accertare la capacità del candidato di utilizzare correttamente le principali strumentazioni di laboratorio, nonché di eseguire autonomamente un protocollo sperimentale.

Testi di studio

B.R. Glick, J.J. Pasternak, Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante, Zanichelli.

K. Wilson, J. Walzer, Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio, Raffaello Cortina Editore.

M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo, METODOLOGIE BIOCHIMICHE - Principi e tecniche per l’espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Casa Editrice Ambrosiana.

R. K. Scopes, Protein purification, principles and practice, Springer-Verlag.

Modalità di
accertamento

Esame orale

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.