LABORATORIO DI BIOTECNOLOGIE II
| A.A. | CFU |
|---|---|
| 2006/2007 | 4 |
| Docente | Ricevimento studentesse e studenti | |
|---|---|---|
| Rita Crinelli |
Assegnato al Corso di Studio
Biotecnologie (1)
| Giorno | Orario | Aula |
|---|
Obiettivi Formativi
Il corso è mirato a fornire agli studenti le competenze riguardanti le strategie e le tecniche più comunemente impiegate in laboratorio per esprimere in E. coli e purificare proteine ricombinanti.
Programma
Lezioni Frontali
1) Scopi dell?espressione di proteine ricombinanti.
2) L'espressione di proteine eterologhe in Escherichia coli.
Caratteristiche di un vettore d'espressione.
Strategie per prevenire la proteolisi in vivo.
Strategie per ovviare alla formazione dei corpi di inclusione.
3) La purificazione di proteine ricombinanti prodotte in Escherichia coli.
Preparazione di un lisato batterico e tecniche di frazionamento iniziale.
Recupero delle proteine dai corpi d'inclusione e refolding in vitro.
Strategie di purificazione: fasi, obiettivi, selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento.
La cromatografia di affinit? nella purificazione delle proteine di fusione.
4) Tecniche elettroforetiche per l'analisi delle proteine e Western-Immunoblotting.
5) Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine
Attivit? di Laboratorio
Durante le esercitazioni di laboratorio, gli studenti saranno guidati nella messa a punto di un protocollo per l'espressione in E. coli e la successiva purificazione di una proteina ricombinante.
Gli esperimenti di laboratorio riguarderanno:
1. determinazione della retta di calibrazione della BSA con metodo Lowry e Bradford;
2. preparazioni delle soluzioni per SDS-PAGE;
3. determinazione del profilo di crescita batterica ed individuazione della fase esponenziale;
4. induzione, raccolta dei pellet batterici, estrazione, frazionamento per centrifugazione e determinazione del contenuto proteico;
5. analisi SDS-PAGE/Western-Immunoblotting della proteina ricombinante nella frazione solubile ed insolubile degli estratti batterici;
6. purificazione della proteina per cromatografia su colonna;
7. analisi SDS-PAGE e Western-Immunoblotting dei campioni ottenuti durante le fasi di purificazione;
8. calcolo della resa e del grado di purificazione.
Durante le esercitazioni di laboratorio, sar? cura degli studenti di compilare un quaderno di laboratorio per imparare a registrare sistematicamente le procedure e i dati nonch? a commentare in modo critico i risultati ottenuti.
Modalità Didattiche, Obblighi, Testi di Studio e Modalità di Accertamento
- Modalità didattiche
- Lezione frontale; laboratorio
- Testi di studio
- B.R. Glick, J.J. Pasternak, Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante, Zanichelli A.J. Ninfa, D.P. Ballou, Metodologie di Base per la Biochimica e la Biotecnologia, Zanichelli K. Wilson, J. Walzer, Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio, Raffaello Cortina Editore R. K. Scopes, Protein purification, principles and practice, Springer-Verlag
- Modalità di
accertamento - Esame orale; quaderno di laboratorio
- Disabilità e DSA
Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.
A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.
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