Il corso é mirato a fornire agli studenti una panoramica sui processi di produzione delle proteine ricombinanti, focalizzando particolarmente l'attenzione su E. coli come sistema di espressione. Nello specifico, saranno prese in esame le strategie sperimentali e le tecniche impiegate per l'espressione, estrazione, purificazione e caratterizzazione dei prodotti ricombinanti.

This laboratory course introduces students to the production of recombinant proteins in Escherichia coli. In particular, the course focuses on some of the most common used strategies and techniques for the expression, extraction, purification and characterization of recombinant proteins.

1. Tecniche elettroforetiche per l'analisi di proteine
1.1 Proprietà ioniche di aminoacidi e proteine
1.2 Aspetti fisici della separazione elettroforetica
1.3 Gel di poliacrilammide
1.4 SDS-PAGE
1.5 Sistema gel/tampone di tipo discontinuo
1.6 Metodi di colorazione
1.7 Western immunoblotting
1.8 PAGE in condizioni native
1.9 Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA)
2. Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine
2.1 Assorbimento a 280 nm
2.2 Metodo Bradford
2.3 Metodo Lowry
3. Escherichia coli come sistema di espressione
3.1 Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti
3.2 Caratteristiche di un sistema di espressione
3.3 Vettori di espressione plasmidici
3.3.1 Sito multiplo di clonaggio e codon usage
3.3.2 Origine di replicazione e copie plasmidiche
3.3.3 I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, PL,T7)
3.3.4 I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi
3.3.5 Il Ribosome Binding Site
4. Strategie per prevenire la proteolisi in vivo
4.1 Proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare
4.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione
4.3 Ingegnerizzazione dell'ospite
4.4 Ingegnerizzazione del prodotto
5. Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione
5.1 Folding delle proteine e formazione dei corpi di inclusione
5.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione
5.3 Ingegnerizzazione dell'ospite
5.3.1 I ceppi "ossidanti"
5.3.2 Co-espressione con chaperon molecolari
5.4 Ingegnerizzazione del prodotto
5.4.1 La secrezione nel periplasma
5.4.2 Le proteine di fusione (MBP, GST, SUMO)
5.5 I tag di fusione
6. Preparazione di un lisato batterico e tecniche di frazionamento iniziale
6.1 Crioconservazione della biomassa
6.2 Metodi di rottura delle cellule batteriche
6.3 Componenti del tampone di estrazione
7. Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione
7.1 Solubilizzazione delle proteine dai corpi di inclusione
7.2 Metodi di refolding in vitro
8. Sviluppo di un protocollo di purificazione
8.1 Chiarificazione dell'estratto
8.2 Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione
8.3 Sviluppo di un saggio specifico
8.4 Selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento
8.5 Resa e grado di purificazione
9. La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione
9.1 La matrice
9.2 Il ligando
9.3 Il braccio spaziatore
9.4 Tecniche di eluizione
10. Caratterizzazione del prodotto proteico
10.1 Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche
10.2 Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici
10.2.1 Test del coniglio
10.2.2 Test del Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) (gel clot, cromogenico, turbidimetrico, ricombinante)
10.2.3 Test di rilascio delle citochine
10.3 Tecniche di eliminazione dei contaminanti endotossinici
10.4 Anticorpi mono- e policlonali
10.5 Strategie di immunizzazione
10.6 Tecniche di purificazione delle immunoglobuline
10.7 Tecniche ELISA
10.7.1 ELISA diretto
10.7.2 ELISA indiretto
10.7.3 ELISA competitivo
11. Espressione e purificazione di una proteina ricombinante: dalla teoria alla pratica di laboratorio
11.1 Preparazione delle soluzioni per SDS-PAGE e allestimento gel
11.2 Determinazione della retta di calibrazione della albumina bovina con metodo Bradford
11.3 Terreni e soluzioni per la crescita batterica e tamponi per l'estrazione di proteine solubili e insolubili
11.4 Crescita batterica e induzione
11.5 Analisi SDS-PAGE degli indotti
11.6 Rottura delle cellule, estrazione delle proteine e frazionamento
11.7 Analisi SDS-PAGE della frazione solubile ed insolubile
11.8 Purificazione della proteina ricombinante tramite cromatografia di affinità
11.9 Analisi SDS-PAGE delle frazioni cromatografiche
11.10 Test LAL, metodica gel clot
11.11 Titolazione di un anticorpo contro un antigene ricombinante tramite test ELISA indiretto

1. Electrophoretic techniques for protein analysis
1.1 Ionic properties of aminoacids
1.2 Physical aspects of the electrophoretic separation
1.3 Polyacrilamide gels
1.4 SDS-PAGE
1.5 Discontinuous gel system
1.6 Gel staining methods
1.7 Western immunoblotting
1.8 Native PAGE
1.9 Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)
2. Spectrophotometric protein assays
2.1 Absorbance at 280 nm
2.2 Bradford method
2.3 Lowry method
3. The Escherichia coli expression system
3.1 Advantages of recombinant protein expression
3.2 Features of the E. coli expression system
3.3 Expression vectors
3.3.1 Multicloning site and codon usage
3.3.2 Replication origin and plasmid copy number
3.3.3 Strong and regulatable promoters (lac, trp, PL,T7)
3.3.4 Antibiotic resistance genes and recessive markers
3.3.5 Ribosome Binding Site
4. Strategies to prevent recombinant protein degradation in vivo
4.1 Bacterial proteases and their cellular localization
4.2 Manipulation of culture conditions
4.3 Host engineering
4.4 Product engineering
5. Strategies to prevent the formation of inclusion bodies
5.1 Protein folding and inclusion body formation
5.2 Manipulation of culture conditions
5.3 Host engineering
5.3.1 "Oxidant" strains
5.3.2 Co-expression with molecular chaperones
5.4 Product engineering
5.4.1 Secretion into the periplasm
5.4.2 Fusion proteins (MBP, GST, SUMO)
5.5 Fusion tags
6. Bacterial lysate preparation and initial fractionation
6.1 Cryoconservation of the biomass
6.2 Cell disruption
6.3 Composition of the protein extraction buffer
7. Recovery of bioactive recombinant proteins from inclusion bodies
7.1 Protein solubilization
7.2 Refolding in vitro
8. Designing a purification scheme
8.1 Lysate clarification
8.2 Key steps in a purification protocol
8.3 Selection of a specific assay for the protein of interest
8.4 Selection and logical combination of purification techniques
8.5 % yield and purification enhancement
9. Purification of fusion proteins by affinity chromatography
9.1 The matrix
9.2 The ligand
9.3 The spacer arm
9.4 Elution techniques
10. Characterization of the protein product
10.1 Bacterial endotoxins: structure and clinical implications
10.2 Techniques for the detection of endotoxin contaminants
10.2.1 Rabbit pyrogen test
10.2.2 Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) test (gel clot, chromogenic, turbidimetric, recombinant)
10.2.3 Test of cytokine release
10.3 Methods for endotoxin removal
10.4 Mono- and polyclonal antibodies
10.5 Immunization techniques
10.6 Immunoglobulin purification methods
10.7 ELISA
10.7.1 direct ELISA
10.7.2 indirect ELISA
10.7.3 competitive ELISA
11. Expression and purification of a recombinant protein: from the theoretical principles to the laboratory practice
11.1 Preparation of the stock solutions for SDS-PAGE
11.2 Setting up of a protein standard curve for the Bradford assay
11.3 Preparation of the culture medium for bacterial growth, buffers for bacterial lysis and extraction of soluble and insoluble proteins
11.4 Bacterial inoculation, growth, induction of recombinant protein expression
11.5 SDS-PAGE analysis of recombinant protein expression
11.6 Cell disruption, protein extraction and initial fractionation
11.7 SDS-PAGE of the soluble and insoluble fraction
11.8 Protein purification by affinity chromatography
11.9 SDS-PAGE analysis of the chromatographic fractions
11.10 LAL test, gel clot
11.11Titration of an antibody against a recombinant antigen by indirect ELISA

nessuna

none

Gli studenti dovranno dimostare di avere acquisito le competenze teorico/pratiche necessarie per esprimere in E. coli, purificare e caratterizzare proteine ricombinanti.

Students must demonstrate to have acquired the knowledge and skills to express in E. coli, purify and characterize recombinant proteins.

nessuna

none

Modalità didattiche

Lezioni frontali e in laboratorio. Il calendario delle lezioni in laboratorio verrà stabilito all'inizio del corso.

Lectures and laboratory lessons. The schedule will be established at the beginning of the course

Obblighi

Per poter sostenere l'esame è obbligatorio seguire almeno due terzi delle lezioni in laboratorio. 

Students must attend at least 2/3 of the laboratory lessons.

 

 

Testi di studio

B.R. Glick, J.J. Pasternak, Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante, Zanichelli.
K. Wilson, J. Walzer, Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio, Raffaello Cortina Editore.
M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo, METODOLOGIE BIOCHIMICHE - Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Casa Editrice Ambrosiana.
R. K. Scopes, Protein purification, principles and practice, Springer-Verlag.

Modalità di
accertamento

Esame orale.

Oral examination

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Obblighi

 

 

Una parte del corso sarà tenuta in lingua inglese. Part of the course will be taught in English. The student can request to sit the final exam in English with an alternative bibliography.