Il corso é mirato a fornire agli studenti una panoramica sui processi di produzione delle proteine ricombinanti, focalizzando particolarmente l'attenzione su E. coli come sistema di espressione. Nello specifico il corso é finalizzato all'acquisizione teorica, ma soprattutto pratica con lezioni in laboratorio, delle strategie sperimentali e delle tecniche impiegate per l'espressione, estrazione, purificazione e caratterizzazione dei prodotti ricombinanti. Le proteine ricombinanti sono prodotti biotecnologici ampiamente utilizzati sia come reagenti di laboratorio che come diagnostici e terapeutici in campo biomedicale, pertanto la conoscenza dei processi, nonché la padronanza delle tecniche necessari per la loro produzione, costituiscono elementi formativi essenziali all'esercizio della professione di Biotecnologo.

L'insegnamento affronterà i seguenti argomenti secondo l'ordine sottoindicato.

LEZIONI IN AULA

1. Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine

1.1 Assorbimento a 280 nm

1.2 Metodo Bradford

1.3 Metodo Lowry

1.4 Metodo BCA

2. Escherichia coli come sistema di espressione

2.1 Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti

2.2 Caratteristiche di un sistema di espressione

2.3 Vettori di espressione plasmidici

2.3.1 Sito multiplo di clonaggio e codon usage

2.3.2 Origine di replicazione e copie plasmidiche

2.3.3 I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, ptac, pL,T7, pBAD)

2.3.4 I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi

2.3.5 Il Ribosome Binding Site

3. Strategie per prevenire la proteolisi in vivo

3.1 Proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare

3.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione

3.3 Ingegnerizzazione dell'ospite

3.4 Ingegnerizzazione del prodotto

4. Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione

4.1 Folding delle proteine e formazione dei corpi di inclusione

4.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione

4.3 Ingegnerizzazione dell'ospite

4.3.1 I ceppi "ossidanti"

4.3.2 Co-espressione con chaperon molecolari

4.4 Ingegnerizzazione del prodotto

4.4.1 La secrezione nel periplasma

4.4.2 Le proteine di fusione (MBP, GST, UB, SUMO)

4.5 I tag di fusione

5. Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione

5.1 Solubilizzazione delle proteine dai corpi di inclusione

5.2 Metodi di refolding in vitro

6. Tecniche elettroforetiche per l'analisi di proteine

6.1 Proprietà ioniche di aminoacidi e proteine

6.2 Aspetti fisici della separazione elettroforetica

6.3 Gel di poliacrilammide

6.4 SDS-PAGE

6.5 Sistema gel/tampone di tipo discontinuo

6.6 Metodi di colorazione

6.7 PAGE in condizioni native

6.8 Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA)

6.9 Western blotting

6.10 Immunoblotting

6.10.1 Bloccaggio

6.10.2 Rilevazione diretta e indiretta

6.10.3 Marcatura degli anticorpi e metodi di rilevazione

7. Preparazione di un lisato batterico e tecniche di frazionamento iniziale

7.1 Crioconservazione della biomassa

7.2 Metodi di rottura delle cellule batteriche

7.3 Componenti del tampone di estrazione

8. Sviluppo di un protocollo di purificazione

8.1 Chiarificazione dell'estratto

8.2 Tecniche di centrifugazione

8.3 Salting in e salting out

8.4 Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione

8.5 Sviluppo di un saggio specifico

8.6 Selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento

8.7 Resa e grado di purificazione

9. La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione

9.1 La matrice

9.2 Il ligando

9.3 Il braccio spaziatore

9.4 Tecniche di eluizione

10. Caratterizzazione del prodotto proteico

10.1 Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche

10.2 Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici

10.2.1 Test del coniglio

10.2.2 Test del Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) (gel clot, cromogenico, turbidimetrico, ricombinante)

10.2.3 Test di rilascio delle citochine

10.3 Tecniche di eliminazione dei contaminanti endotossinici

10.4 Anticorpi mono- e policlonali

10.5 Strategie di immunizzazione

10.6 Tecniche di purificazione delle immunoglobuline

10.7 Tecniche ELISA

10.7.1 ELISA diretto

10.7.2 ELISA indiretto

10.7.3 ELISA competitivo

LEZIONI IN LABORATORIO

11. Espressione e purificazione di una proteina ricombinante: dalla teoria alla pratica di laboratorio

11.1 Dosaggio proteico a 280 nm e determinazione della retta di calibrazione dell'albumina bovina e della beta-lattoglobulina con metodo Bradford

11.2 Crescita batterica e induzione; preparazione tamponi per l'estrazione di proteine solubili e insolubili

11.3 Rottura delle cellule, estrazione delle proteine e frazionamento solubile/insolubile

11.4 Analisi SDS-PAGE dell'espressione e solubilità; preparazione tamponi per la cromatografia

11.5 Purificazione della proteina ricombinante tramite cromatografia di affinità

11.6 Analisi SDS-PAGE delle frazioni cromatografiche; western blotting della proteina purificata

11.7 Immunoblotting

11.8 Test LAL, metodica gel clot

11.9 Titolazione di un anticorpo contro un antigene ricombinante tramite test ELISA indiretto

nessuna

D1-Conoscenza e capacità di comprensione. Lo studente avrà la conoscenza delle strategie più comunemente utilizzate per esprimere, purificare e caratterizzare proteine ricombinanti. In particolare, sarà a conoscenza di vantaggi e problematiche connesse all’utilizzo di E. coli come sistema di espressione e saprà come affrontare quest’ultime attraverso approcci di manipolazione delle condizioni di fermentazione o ricorrendo ad ingegnerizzazione genetica dell’ospite e/o del prodotto. Saprà come conservare la biomasssa, preparare un estratto batterico, strutturare un protocollo di purificazione. Sarà a conoscenza dei principi e dei possibili impieghi delle tecniche utilizzate in laboratorio. Sarà inoltre formato sulle più avanzate tecniche immunologiche e di rilevazione dei contaminanti endotossinici per la caratterizzazione di prodotti ricombinanti ad uso diagnostico/clinico.

D2-Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Lo studente sarà in grado di seguire, sotto la supervisione di personale specializzato, un processo di produzione di proteine ricombinanti comprendendone tutte le fasi, dall’espressione, alla purificazione e alla caratterizzazione del prodotto. Saprà comprendere ed eseguire un protocollo sperimentale fornito, e sarà in grado di allestire un semplice protocollo autonomamente sulla base di obiettivi delineati.

D3-Autonomia di giudizio. Lo studente sarà capace di acquisire i dati, presentarli in forma grafica e criticamente commentare i risultati. Saprà individuare problematiche legate al processo di produzione e proporre soluzioni.

D4-Abilità comunicative. Lo studente saprà descrivere un processo di produzione e le tecniche impiegate, nonché commentare i risultati sperimentali utilizzando un linguaggio appropriato.

D5-Capacità di apprendimento. Lo studente avrà le basi per poter leggere autonomamente e criticamente la letteratura di settore, approfondendo gli aspetti di interesse. Lo studente saprà porre domande e fornire risposte.

Il materiale didattico predisposto dalla/dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni della/del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it

12 ore di lezione (frontali con lezioni in laboratorio) tenute dalla Dott.ssa Sabrina Dominici - Senior Research&Development Researcher (Diatheva srl, Cartoceto, PU)

Modalità didattiche

Lezioni frontali e in laboratorio. Il calendario delle lezioni in laboratorio verrà stabilito all'inizio del corso.

Obblighi

Per poter sostenere l'esame è obbligatorio seguire almeno due terzi delle lezioni in aula e due terzi delle lezioni in laboratorio.

Per poter frequentare i laboratori é obbligatorio avere seguito e superato il test finale dei corsi online di “Formazione generale sulla sicurezza per i lavoratori” e “Sicurezza nel laboratorio Chimico e Biologico” (referente per la sicurezza, Prof. Annarita Mastrogiacomo).

Per svolgere adeguatamente le attività previste dall’insegnamento è fortemente consigliato avere superato l'esame o quantomeno seguito i corsi di Laboratorio di Biotecnologie I e Laboratorio di Biotecnologie II. E' altresì importante avere acquisito i contenuti dei corsi di Biochimica e Biologia Molecolare.

Testi di studio

B.R. Glick, J.J. Pasternak, Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante, Zanichelli.
K. Wilson, J. Walzer, Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio, Raffaello Cortina Editore.
M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo, METODOLOGIE BIOCHIMICHE - Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Casa Editrice Ambrosiana.
R. K. Scopes, Protein purification, principles and practice, Springer-Verlag.

altro materiale di studio e/o approfondimento (diapositive delle lezioni, protocolli, review in lingua inglese) saranno forniti durante il corso sulla piattaforma Moodle.

Modalità di
accertamento

Colloquio orale. Verranno poste allo studente almeno tre domande riguardanti le nozioni teoriche con rimandi specifici alla prassi di laboratorio (tecniche e procedure). Almeno una delle domande riguarderà nello specifico i contenuti delle lezioni in laboratorio. A tal fine gli studenti dovranno fornire al docente, prima del termine del corso, una elaborazione in forma di figura(e) dei dati sperimentali raccolti (le modalità saranno stabilite in itinere e specifiche indicazioni sulla natura dell'elaborato saranno fornite durante le lezioni). In sede di esame, iI docente chiederà di descrivere e commentare criticamente quanto riportato in una delle figure secondo lo schema: scopo, procedura, risultato, commento.

Concorrono a determinare il voto: il livello di padronanza delle nozioni teoriche e la capacità di applicarle ad esempi concreti, il livello di articolazione e la pertinenza delle risposte, la proprietà di linguaggio, incluso l'utilizzo di terminologia tecnica appropriata, la capacità di esposizione.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Per le lezioni di laboratorio gli studenti saranno suddivisi in tre gruppi per motivi di capienza del laboratorio didattico (35 persone) 

La suddivisione in gruppi sarà stabilita all'inizio del corso