Il corso é mirato a fornire agli studenti una panoramica sui processi di produzione delle proteine ricombinanti, focalizzando particolarmente l'attenzione su E. coli come sistema di espressione. Nello specifico il corso é finalizzato all'acquisizione teorica, ma soprattutto pratica con lezioni in laboratorio, delle strategie sperimentali e delle tecniche impiegate per l'espressione, estrazione, purificazione e caratterizzazione dei prodotti ricombinanti. Le proteine ricombinanti sono prodotti biotecnologici ampiamente utilizzati sia come reagenti di laboratorio che come diagnostici e terapeutici in campo biomedicale e biocatalizzatori nell'industia, pertanto la conoscenza dei processi, nonché la padronanza delle tecniche necessarie per la loro produzione, costituiscono elementi formativi essenziali all'esercizio della professione di Biotecnologo.

L'insegnamento affronterà i seguenti argomenti secondo l'ordine sottoindicato.

LEZIONI IN AULA

1. Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine

1.1 Assorbimento a 280 nm

1.2 Metodo Bradford

1.3 Metodo Lowry

1.4 Metodo BCA

2. Escherichia coli come sistema di espressione

2.1 Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti

2.2 Caratteristiche di un sistema di espressione

2.3 Vettori di espressione plasmidici

2.3.1 Sito multiplo di clonaggio e codon usage

2.3.2 Origine di replicazione e copie plasmidiche

2.3.3 I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, ptac, pL,T7, pBAD)

2.3.4 I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi

2.3.5 Il Ribosome Binding Site

3. Strategie per prevenire la proteolisi in vivo

3.1 Proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare

3.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione

3.3 Ingegnerizzazione dell'ospite

3.4 Ingegnerizzazione del prodotto

4. Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione

4.1 Folding delle proteine e formazione dei corpi di inclusione

4.2 Applicazioni Biotecnologiche dei corpi di inclusione

4.3 Manipolazione delle condizioni di fermentazione

4.4 Ingegnerizzazione dell'ospite

4.4.1 I ceppi "ossidanti"

4.4.2 Co-espressione con chaperon molecolari

4.5 Ingegnerizzazione del prodotto

4.5.1 La secrezione nel periplasma

4.5.2 Le proteine di fusione (MBP, GST, UB, SUMO)

4.5.2.1 Uso delle proteasi per la rimozione del partner di fusione

4.5.2.2 I peptidi autotaglianti

4.6 I tag di fusione

4.6.1 Tag combinatoriale

5. Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione

5.1 Solubilizzazione delle proteine dai corpi di inclusione

5.2 Metodi di refolding in vitro

6. Tecniche elettroforetiche per l'analisi di proteine

6.1 Proprietà ioniche di aminoacidi e proteine

6.2 Aspetti fisici della separazione elettroforetica

6.3 Gel di poliacrilammide

6.4 SDS-PAGE

6.5 Sistema gel/tampone di tipo discontinuo

6.6 Metodi di colorazione

6.7 PAGE in condizioni native

6.8 Saggio di spostamento della mobilità elettroforetica (EMSA)

6.9 Western blotting

6.10 Immunoblotting

6.10.1 Bloccaggio

6.10.2 Rilevazione diretta e indiretta

6.10.3 Marcatura degli anticorpi e metodi di rilevazione

7. Preparazione di un lisato batterico

7.1 Crioconservazione della biomassa

7.2 Metodi di rottura delle cellule batteriche

7.3 Componenti del tampone di estrazione

8. Tecniche di frazionamento iniziale e sviluppo di un protocollo di purificazione

8.1 Chiarificazione dell'estratto

8.2 Tecniche di centrifugazione

8.3 Salting in e salting out

8.4 Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione

8.5 Sviluppo di un saggio specifico

8.6 Selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento

8.7 Resa e grado di purificazione

9. La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione

9.1 La matrice

9.2 Il ligando

9.3 Il braccio spaziatore

9.4 Tecniche di eluizione

9.5 Ligandi biologici e strutturali utilizzati per la purificazione di proteine ricombinanti

10. Caratterizzazione del prodotto proteico

10.1 Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche

10.2 Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici

10.2.1 Test del coniglio

10.2.2 Test del Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) (gel clot, cromogenico, turbidimetrico, ricombinante)

10.2.3 Test di rilascio delle citochine

10.3 Tecniche di eliminazione dei contaminanti endotossinici

10.4 Anticorpi mono- e policlonali

10.5 Strategie di immunizzazione

10.6 Tecniche di purificazione delle immunoglobuline

10.7 Tecniche ELISA

10.7.1 ELISA diretto

10.7.2 ELISA indiretto

10.7.3 ELISA competitivo

11. Stabilizzazione e conservazione del prodotto ricombinante

LEZIONI IN LABORATORIO

11. Espressione e purificazione di una proteina ricombinante: dalla teoria alla pratica di laboratorio

11.1 Dosaggio proteico a 280 nm e determinazione della retta di calibrazione dell'albumina bovina e della beta-lattoglobulina con metodo Bradford

11.2 Crescita batterica e induzione

11.3 Rottura delle cellule, estrazione delle proteine e frazionamento solubile/insolubile

11.4 Analisi SDS-PAGE dell'espressione e solubilità

11.5 Purificazione della proteina ricombinante tramite cromatografia di affinità (IMAC)

11.6 Analisi SDS-PAGE delle frazioni cromatografiche

11.7 Saggio di rimozione del partner di fusione

11.8 analisi western immunoblotting del prodotto ricombinante

11.9 Titolazione di un anticorpo contro un antigene ricombinante tramite test ELISA indiretto

nessuna

D1-Conoscenza e capacità di comprensione. Lo studente dovrà dimostrare di conoscere le strategie più comunemente utilizzate per esprimere, purificare e caratterizzare proteine ricombinanti. In particolare, dovrà essere a conoscenza di vantaggi e problematiche connesse all’utilizzo di E. coli come sistema di espressione e dovrà sapere come affrontare quest’ultime attraverso approcci di manipolazione delle condizioni di fermentazione o ricorrendo ad ingegnerizzazione genetica dell’ospite e/o del prodotto. Lo studente dovrà essere in grado di conservare la biomasssa, preparare un estratto batterico, strutturare un protocollo di purificazione. Dovrà dimostrare di conoscere i principi e i possibili impieghi delle tecniche utilizzate in laboratorio. Dovrà dimostrare di essere formato sulle più avanzate tecniche immunologiche e di rilevazione dei contaminanti endotossinici per la caratterizzazione di prodotti ricombinanti ad uso diagnostico/clinico.

D2-Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Lo studente dovrà essere in grado di seguire, sotto la supervisione di personale specializzato, un processo di produzione di proteine ricombinanti comprendendone tutte le fasi, dall’espressione, alla purificazione e alla caratterizzazione del prodotto. Dovrà inoltre essere in grado di comprendere ed eseguire un protocollo sperimentale fornito, e di allestire un semplice protocollo autonomamente sulla base di obiettivi delineati.

D3-Autonomia di giudizio. Lo studente dovrà dimostrare di essere capace di acquisire i dati, presentarli in forma grafica e criticamente commentare i risultati. Dovrà individuare problematiche legate al processo di produzione e proporre soluzioni.

D4-Abilità comunicative. Lo studente dovrà essre in grado di descrivere un processo di produzione e le tecniche impiegate, nonché di commentare i risultati sperimentali utilizzando un linguaggio appropriato.

D5-Capacità di apprendimento. Lo studente dovrà essere in grado di leggere autonomamente e criticamente la letteratura di settore, approfondendo gli aspetti di interesse. Lo studente dovrà essere in grado di porre domande e fornire risposte.

Il materiale didattico predisposto dalla/dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni della/del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it

Modalità didattiche

Lezioni in aula (3 CFU) sui principi delle tecniche e sulle strategie impiegate per esprimere prodotti ricombinanti

Lezioni pratiche in laboratorio/aula informatica (5 CFU)  sulla verifica espressione, solubilità, purificazione e caratterizzazione di una proteina ricombinante con analisi ed elaborazione dei dati e loro redazione in forma grafica. Durante le lezioni saranno proposte attività di "problem solving".

lezioni video (in inglese con sottotitoli in italiano) di approfondimento o ripasso da piattaforma JoVE  (erogati tramite link diretto su piattaforma Moodle di Ateneo)

Obblighi

Per poter sostenere l'esame è obbligatorio seguire almeno due terzi delle lezioni in laboratorio, nonché avere caricato su blended e-learning, prima della chiusura delle liste, l'elaborato descritto in "modalità di accertamento".

Per poter frequentare i laboratori é obbligatorio avere seguito e superato il test finale dei corsi online di “Formazione generale sulla sicurezza per i lavoratori” e “Sicurezza nel laboratorio Chimico e Biologico”.

Testi di studio

B.R. Glick, J.J. Pasternak, Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante, Zanichelli.
K. Wilson, J. Walzer, Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio, Raffaello Cortina Editore.
M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo, METODOLOGIE BIOCHIMICHE - Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Casa Editrice Ambrosiana.
R. K. Scopes, Protein purification, principles and practice, Springer-Verlag.

altro materiale di studio e/o approfondimento (diapositive delle lezioni, protocolli, review in lingua inglese) saranno forniti durante il corso sulla piattaforma Moodle.

Modalità di
accertamento

Colloquio orale. Verranno poste allo studente almeno tre domande riguardanti le nozioni teoriche con rimandi specifici alla prassi di laboratorio (tecniche e procedure). Almeno una delle domande riguarderà nello specifico i contenuti delle lezioni in laboratorio. A tal fine gli studenti dovranno caricare su blended (in una cartella predisposta appositamente dal docente) un elaborato (in formato pdf) contenente i dati sperimentali raccolti in laboratorio, organizzati in forma di figure/grafici (specifiche indicazioni saranno fornite durante le lezioni). In sede di esame, iI docente chiederà di descrivere e commentare criticamente quanto riportato nell'elaborato secondo lo schema: scopo, procedura, risultato, commento. 

Concorrono a determinare il voto: il livello di padronanza delle nozioni teoriche e la capacità di applicarle ad esempi concreti, il livello di articolazione e la pertinenza delle risposte, la proprietà di linguaggio, incluso l'utilizzo di terminologia tecnica appropriata, la capacità di esposizione.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Modalità didattiche

NON PREVISTO - corso con obbligo di frequenza

Per svolgere adeguatamente le attività previste dall’insegnamento è fortemente consigliato avere superato l'esame o quantomeno seguito i corsi di Laboratorio di Biotecnologie I e Laboratorio di Biotecnologie II. E' altresì importante avere conoscenze di biochimica e chimica  (inorganica, organica e analitica) di base e di Biologia Molecolare.