Il corso si propone di fornire agli studenti le conoscenze teoriche e le competenze pratiche per esprimere in E. coli e purificare proteine ricombinanti. E' considerato obiettivo formativo anche l'acquisizione della capacità di registrare in modo sistematico dati e procedure e di valutare criticamente i risultati sperimentali ottenuti.

LEZIONI FRONTALI

1.     Tecniche elettroforetiche per l'analisi di proteine e Western Immunoblotting.

2.     Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine.

3.     Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti.

4.     L'espressione di proteine eterologhe in E. coli.

4.1 Caratteristiche di un vettore di espressione.

4.2 Strategie per prevenire la proteolisi in vivo.

4.3 I corpi di inclusione: vantaggi, svantaggi, strategie per prevenirne la formazione (condizioni di fermentazione, ingegnerizzazione dell'ospite, ingegnerizzazione del prodotto).

5.     La purificazione di proteine ricombinanti prodotte in E. coli.

5.1 Preparazione di un lisato batterico e tecniche di frazionamento iniziale.

5.2 Recupero delle proteine dai corpi di inclusione e refolding in vitro.

5.3 Sviluppo di un protocollo di purificazione: fasi, obiettivi, selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento.

5.4 La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione.

 ESERCITAZIONI DI LABORATORIO

1.     Determinazione della retta di calibrazione della BSA con metodo Bradford.

2.     Preparazione delle soluzioni per SDS-PAGE e allestimento di un gel.

3.     Crescita batterica, induzione, raccolta dei batteri, estrazione delle proteine e determinazione del contenuto proteico.

4.     Analisi SDS-PAGE/Western Immunoblotting della frazione solubile ed insolubile dei lisati batterici.

5.     Purificazione della proteina di fusione tramite cromatografia di affinità.

6.     Analisi SDS-PAGE/Western Immunoblotting delle frazioni cromatografiche.

7.     Calcolo della resa e del grado di purificazione.

Modalità didattiche

Lezione frontale; esercitazioni di laboratorio

Obblighi

Obbligo di frequenza dell'attività di laboratorio per 2/3 delle ore complessive.

Testi di studio

• B.R. Glick, J.J. Pasternak, Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante, Zanichelli.
• A.J. Ninfa, D.P. Ballou, Metodologie di Base per la Biochimica e la Biotecnologia, Zanichelli.
• K. Wilson, J. Walzer, Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio, Raffaello Cortina Editore.
• R. K. Scopes, Protein purification, principles and practice, Springer-Verlag.

• articoli e riferimenti specifici aggiornati indicati dal docente durante il corso.

Modalità di
accertamento

Esame orale; quaderno di laboratorio (vedi note).

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Durante le esercitazioni di laboratorio gli studenti dovranno compilare individualmente un quaderno di laboratorio. Il quaderno rimane in laboratorio per tutta la durata del corso ed è riconsegnato allo studente prima dell'esame. Il quaderno è oggetto di discussione durante l'esame orale e la sua corretta compilazione, valutata dal docente, concorre assieme alla prova orale a determinare il voto finale.