Il corso intende fornire le nozioni di base relative ai metodi di indagine biochimica, applicati allo studio delle proteine. degli enzimi e dei metaboliti in cellule animali e vegetali. Nelle esperienze di laboratorio gli studenti saranno messi in grado di eseguire un dosaggio enzimatico. purificare una proteina. Fare un gel elettroforetico.  dosare un metabolita.

The aims of the course is to provide students with the tools  to understand the methods for the study of proteins (enzymes) and metabolites in animal and vegetable cells. With the lab experiences, the students will be able to assay the activity of an enzyme, to purify a protein and measure the concentration of a metabolite as well as to perform an electrophoresis.

Il processo scientifico.
Il metodo ipotetico deduttivo, rapporto fra scienza e tecnica, ricaduta sulla società delle scoperte scientifiche e della tecnologia.  Il codice etico nelle ricerche biomediche.
 
Studi in vivo ed ex-vivo.
Utilizzo di animali da esperimento: modificazione della dieta, somministrazione di farmaci, animali transgenici e knoch out. Metodi di studio con cellule ottenuti da tessuti normali e tumorali. Separazione di cellule e organuli sub cellulari: gradiente di densità continuo e isopicnico.
 
Omogenati cellulari.
Lisato di eritrociti (RBC) con tamponi, antiproteolitici, composti riducenti. (con esperienza di laboratorio) Omogenizzazione delle cellule con potter, ultraturrax, sonicazione, omogenizzatori in continuo a pressione.
 
Studio degli enzimi e delle proteine.
Dosaggio dell’attività enzimatica con metodi spettrofotometrici ( con esperienza di laboratorio), fluorimetrici, radiochimici. Cinetica enzimatica: calcolo della Km, Ki, Ka. Studio del tipo di inibizione: competitiva, non competitiva, incompetitiva e mista. Uso degli analoghi dei substrati, effetto del pH e della temperatura.
Quantificazione delle proteine: assorbanza a 280 e 260 nm, metodo del Biureto, di Lowry, di Bradford ( con esperienza di laboratorio). Purificazione delle proteine con tecniche cromatografiche: gel filtrazione, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità, cromatografia di immunoaffinità, cromatografia per interazioni idrofobiche, cromatografia a fase inversa. Applicazioni dell’HPLC..
 
 
Elettroforesi. Elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native o denaturanti (SDS-PAGE), (con esperienza di laboratorio) tecniche di rivelazione, analisi quantitativa densitometrica delle bande, determinazione del peso molecolare, elettroforesi su gradiente, elettroforesi preparativa, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale, western blotting.
 
Dosaggio dei metaboliti. Deproteinizzazione acida o basica. Dosaggio di metaboliti con metodi spettrofotometrici (con esperienza di laboratorio), spettrofluorimetrici, Dosaggio ATP, glucosio. Uso dell’HPLC nel dosaggio dei metaboliti.
 
Tecniche immunologiche.
Produzione di anticorpi policlonali e monoclonali, Purificazione di anticorpi, verifica della immunoreattività, curve di immunotitolazione, applicazioni immunoistochimiche e citochimiche, sistemi ELISA. Metodi radiochimici (RIA).
Spettroscopie avanzate. spettrometria di massa, NMR, EPR, spettroscopia di assorbimento atomico

 ( English version)
 The scientific process: the hypothetic deductive method. The ethic code for animal and human experimentation.

In vivo studies: diet changes. drug administration, transgenic  and knock-out animals

In Vitro studies: perfused organs, tissue slices, primary cultured cells, immortalized cell lines.

Centrifugation techniques. Separations of cells and subcellular organules by isopycnic and differential centrifugation

Red Blood cells lysis and preparation of the haemolysates. Buffers and antiproteolitic cocktails, reducing and stabilizing compounds.

Omogenization of tissues by means of potter, ultraturrax. French Press, sonication.

Measurement of enzymatic activity: spectrophotometric. Fluorimetric and radiochemical methods. Determination of the kinetic characteristics: Km. Ki. pH curves. Thermal stability. Protein studies and quantification: absorbance at 280 e 260 nm, method of Bradford. Biureto, Lowry.

Protein purification by conventional chromatography: gel filtration, Ionic exchange, affinity, immunoaffinity. Hydrophobic interactions. High performance liquid chromatography (HPLC) by riverse and direct phase.

Protein primary structure determination by means of the Edman degradation.

Electrophoresis on polyacrylamide gel under native and denaturing conditions (SDS-PAGE), densitometric analysis of the protein bands. Determination of protein molecular weight. Preparative electrophoresis, isoelectrofocusing. 2-D Electrophoresis. Capillary Electrophoresis.

Metabolite assays: deproteinization methods. Assay of metabolites by spectrophotometric. fluorimetric and radiochemical methods.

Advanced spectroscophy: Infra red spectroscopy. NMR, EPR, Mass Spectrometry.

Immunochemical techniques: production of monoclonal and plyclonal antibodies, immunotitration curves, immunocytochemical detection of proteins. Direct and indirect ELISA systems. Radiochemical methods (RIA).

Si richiede l'esame di Biochimica  ; it is needed  to have passed Biochemistry (second year)

Si farà riferimento ai risultati previsti dai descrittori di Dublino;

 The Dublin’s Descriptors will be the teaching goals

Si svolgeranno esercitazioni di laboratorio con la collaborazione del Dr Giordano Serafini. Dott.sse Paola Ceccaroli e Roberta Saltarelli. Gli studenti eseguiranno le seguenti esperienze: dosaggio dell’attività di un enzima, dosaggio di un metabolita. Cromatografia. Elettroforesi in SDS. Gli studenti riceveranno protocolli e file in word delle esperienze di laboratorio.

Students will perform the following lab experiences: assay of enzymatic activity and a metabolite, purification of a protein, SDS-PAGE with the help of the Dr Giordano Serafini. Dr Paola Ceccaroli e Roberta Saltarelli. The students will receive the protocols of the lab experiences and /or  the electronic file

Modalità didattiche

Lezioni frontali, laboratori, esercitazioni di gruppo e test individuali con domande a risposta aperta.

The course will consists in lecturers and lab experiences. Intermediate tests to evaluate the level of  knowledge will be proposed monthly.

Obblighi

Non viene imposto l'obbligo di frequenza ma è vivamente consigliato frequentare le attività pratiche e di laboratorio.

The  participation to the lecturers is not compelling, but students are warmly requested to participate to the lab experiences

Testi di studio

 De Marco-Cini “Principi di metodologie biochimiche”, Piccin, 2009;

 

Modalità di
accertamento

Esame orale.

Oral examination (can be either in English or Italian)

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Modalità didattiche

Prelevare i ppt delle lezioni dalla biblioteca area scientifica, il libro di testo e i protocolli delle esperienze di laboratorio che saranno la premessa indispensabile per sostenere l'esame

Obblighi

Procurarsi e comprendere le esperienze di laboratorio

Testi di studio

 Testo consigliato: De Marco-Cini “Principi di metodologie biochimiche”, Piccin, 2009

 Lezioni teoriche con laboratori ( per i quali e rilasciato il protocollo di lavoro) ed esame orale.

Modalità di
accertamento

Esame orale

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Lo studente dave procurarsi il materiale indicato nelle precedenti sezioni con largo anticipo prima dell'esame