L'obiettivo dell'insegnamento è quello di fornire allo studente le basi pratiche per l’applicazione delle principali metodologie del DNA Ricombinante, di uso comune nei moderni laboratori di biologia molecolare. Saranno inoltre trattate le conoscenze teoriche delle esperienze di laboratorio e gli aspetti teorico-pratici di altre metodiche di manipolazione ed analisi degli acidi nucleici.

The objective of the course is to provide students with the basis of the main technique of recombinant DNA in laboratory experiences and their applications; during the course it will also explained the theoretical aspects of the lab experiences and other  nucleic acid manipulation techniques

 Attività di laboratorio con relativa lezione sul protocollo specifico:
1. Isolamento di DNA da cellule eucariotiche
2. Analisi elettroforetica del DNA estratto (analisi qualitativa)

3. Quantificazione del DNA estratto con spettrofotometro
4. Allestimento di un esperimento di PCR
5. Analisi del prodotto di PCR attraverso elettroforesi su gel di agarosio

6. Purificazione dei prodotti di PCR

7. Purificazione del DNA plasmidico specifico per il clonaggio

8. Clonaggio del prodotto di PCR attraverso la reazione di ligasi (T/A)

9. Trasformazione dei batteri E. Coli con il plasmide ricombinante

10. Screening dei cloni positivi attraverso PCR o tecniche classiche

11. Digestione con enzimi di restrizione di DNA genomico o DNA plasmidico

12. Risoluzione dei problemi

Lezioni frontali su metodiche e le possibili applicazioni della tecnologia del DNA ricombinante. Descrizione dei protocolli inerenti ogni singola esercitazione. Gli argomenti trattati saranno:
1. Preparazione dei campioni biologici
2. Metodi di purificazione degli acidi nucleici (DNA/RNA genomico, DNA plasmidico)
3. Tecniche di quantificazione degli acidi nucleici

4. Elettroforesi in gel d'agarosio

5. Tecniche di ibridazione e marcatura di acidi nucleici

6. Enzimi per il clonaggio di DNA e altre applicazioni

7. Biologia di base dei vettori plasmidici e fagici

8. Strategie di clonaggio: vettori e cellule ospiti

9. Tecniche di trasformazione in cellule procariotiche

10. Principali strategie per l’identificazione ed analisi dei cloni ricombinanti

11. Reazione a catena della polimerasi (PCR) aspetti pratici e applicazioni:

11.1 end-point PCR

11.2 reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

11.3 real time PCR

11.4 real time PCR quantitativa (qrt-PCR)

11.5 Altri metodi di PCR

12. Tecnologia del DNA ricombinante nella ricerca

12.1 Esempi di applicazione delle tecniche e risultati ottenuti

(English version)

Laboratory activities and lectures related to the experiences:

1. Isolation of genomic DNA from eukaryotic cells

2. Agarose gel electrophoresis analysis (qualitative analysis) of extracted DNA

3. Quantification of DNA by spectrophotometric analysis

4. Set up PCR with specific primers

5. Analysis  of PCR product (target gene) by agarose gel electrophoresis

6. Purification of PCR product

7. Plasmid DNA purification (specific vector)

8. Cloning of target gene obtained by PCR with T/A ligation

9. Transformation in E. Coli bacteria with recombinant plasmid

10. Screening of transformed colonies  by PCR or with traditional method

11. Digestion of recombinant DNA plasmid with a restriction enzyme

12. Troubleshooting

Lectures in recombinant DNA technology, protocols and applications:

1. Biological sample preparations

2. Methods for nucleic acid purification (genomic DNA, total RNA, plasmid DNA)

3. Methods for nucleic acids quantification

4. Agarose gel electrophoresis

5. Transfer of nucleic acids on the membrane:  Southern/Northern blotting.

6. Enzymes for cloning of DNA and other applications

7. Biology of plasmid and phage vectors
8. Strategy of DNA cloning: vectors, host cells

9. Prokaryotic cell transformation technique

10. Main strategies for identification and analysis of recombinant DNA

11. Polymerase Chain Reaction (PCR), practical aspect sand applications:

11.1 end-point PCR

11.2 reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR)

11.3 real time PCR,

11.4 quantitative real time PCR (qrt-PCR)

11.5 Other PCR methods

12.Recombinant DNA techniques in the research

12.1 Examples of method's applications with results

Modalità didattiche

Esperienze di laboratorio, lezioni frontali, applicazioni delle metodologie del DNA ricombinante nella ricerca, protocolli e dispense distribuite dal docente durante le lezioni frontali e in laboratorio.

The course will consists in lab practical experiences, lecturers, applications of DNA recombinant methodology in research and other teaching tools (i.e.protocols and handouts)

Obblighi

L'ammissione alla prova di esame è consentita agli studenti che abbiano frequentato almeno i 2/3 delle ore di laboratorio.

The evaluation of the course will be done through an final exam for students who have attended at least 2/3 of lab hours

Testi di studio

Brown T.A. , Biotecnologie molecolari, 2007, Zanichelli

Reece J. R. , Analisi dei geni e genomi, 2006, Edises

Watson J.D. , Caudy A.A. , Myers R.M., Witkowski J.A. DNA ricombinante Geni e genomi, 2008, Zanichelli

Karcher S.J., Laboratorio di biologia molecolare, 2010 Zanichelli

Wilson K., Walker J. M.,  Biochimica e Biologia Molecolare, 2006, Raffaello Cortina Editore

Modalità di
accertamento

Esame scritto/orale.
Written /oral examination

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Obblighi

Gli stessi degli studenti frequentanti.

 

The same as for students attending.

Testi di studio

Gli stessi degli studenti frequentanti.

The same as for students attending.

Modalità di
accertamento

Gli stessi degli studenti frequentanti.

The same as for students attending.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.