Il corso si propone di trasmettere le conoscenze teoriche e le competenze pratiche delle più comuni tecniche di clonaggio del DNA, utilizzate per studiare la struttura e la funzione dei geni (dal DNA alla proteina). Al termine del corso, gli studenti dovranno dimostrare di aver acquisito una buona conoscenza della tecnologia del DNA ricombinante e di essere in grado di progettare e realizzare un esperimento di clonaggio in piena autonomia.

(ENGLISH VERSION)
The goal of this course is to give the basic theoretical notions and practical skills of the most popular DNA cloning techniques used to investigate the structure and function of genes (from DNA to protein). At the end of the course the students are expected to acquire a good knowledge of the recombinant DNA technology and to develop skills in designing and performing a cloning experiment autonomously.

Attività di laboratorio
1. Definizione obiettivo del clonaggio e progettazione della strategia di clonaggio.
1.1 Selezione del gene da clonare e del vettore di clonaggio.
1.2 Selezione degli enzimi di restrizione da utilizzare e progettazione di primer degenerati.
2. Isolamento di RNA totale dalla fonte di partenza selezionata.
2.1 Analisi elettroforetica e dosaggio spettrofotometrico dell'RNA estratto.
3. Sintesi di cDNA dall'RNA isolato, tramite trascrizione inversa (RT).
4. PCR con primer degenerati e verifica del prodotto su gel di agaroso.
5. Inserimento diretto del prodotto di PCR in un vettore plasmidico tramite la strategia TA cloning.
6. Trasformazione di cellule E. coli competenti con la reazione di ligasi.
7. Screening e identificazione dei cloni ricombinanti.
7.1 PCR su colonie.
7.2 Estrazione (miniprep) e analisi di sequenza dei cloni con inserto.
8. Trasferimento del gene target in un vettore di espressione batterico, tramite clonaggio direzionale con enzimi di restrizione.
9. Trasformazione di cellule batteriche ospiti, screening e propagazione.

Lezioni frontali (a supporto delle attività di laboratorio)
1. Clonaggio del DNA: overview su enzimi, vettori, cellule ospiti.
1.1 Enzimi per il clonaggio del DNA: nucleasi, ligasi, polimerasi, fosfatasi.
1.2 Vettori di clonaggio per E. coli e per cellule eucariotiche: plasmidi, fagi, cosmidi, fasmidi, BAC, YAC.
1.3 Sistemi biologici della biotecnologia molecolare: batteri, lieviti, eucarioti superiori.
2. Introduzione di DNA in cellule vive.
2.1 La trasformazione genetica dei procarioti.
3. Genoteche a DNA genomico e a cDNA.
3.1 Preparazione di DNA genomico e di cDNA per la generazione di genoteche.
4. Strategie di screening delle genoteche.
4.1 Colony e plaque hybridization.
4.2 Purificazione di vettori ricombinanti e analisi tramite enzimi di restrizione e/o sequenziamento.
5. Reazione a catena della polimerasi (PCR) come alternativa al clonaggio "cell-based".
6. Tecniche di base della tecnologia del DNA ricombinante
6.1 Isolamento di acidi nucleici.
6.2 Quantificazione di acidi nucleici (dosaggio spettrofotometrico) e sizing del DNA da gel.
6.3 Elettroforesi su gel di agaroso.
6.4 Trasferimento e immobilizzazione di acidi nucleici dal gel a un supporto solido: Southern/Northern blotting.
6.5 Ibridazione degli acidi nucleici.
6.6. Produzione di sonde marcate.
6.7 Sequenziamento del DNA.
6.8 Preparazione di piastre di LB agar e streaking di batteri.
6.9 Inoculo di batteri in terreno liquido e preparazione di stock in glicerolo per la conservazione a lungo termine.

(ENGLISH VERSION)

Laboratory experiences
1. Defining the goal of the cloning experiment and design of the cloning strategy.
1.1 Selection of gene to be cloned and cloning vector.
1.2 Selection of restriction enzymes to be used and design of degenerate primers.
2. Isolation of total RNA from the selected source.
2.1 Electrophoresis of purified RNA and spectrophotometric quantification.
3. cDNA synthesis from total RNA, by reverse transcription (RT).
4. PCR with degenerate primers and analysis of the amplified product by agarose gel electrophoresis.
5. Direct insertion of PCR product into a plasmid vector by the TA cloning strategy.
6. Transformation of competent E. coli cells with the ligase reaction.
7. Screening and identification of recombinant clones.
7.1 PCR from bacterial colonies.
7.2 Extraction (miniprep) and sequencing of positive recombinant clones.
8. Transfer (subcloning) of the target gene into a prokaryotic expression vector, by restriction-based directional cloning.
9. Transformation, screening and propagation of host bacterial cells.

Lectures (supporting practical experiences)
1. DNA cloning: overview of enzymes, vectors, host cells.
1.1 Enzymes for DNA cloning: nucleases, ligases, polymerases, phosphatases.
1.2 Cloning vectors for E. coli and eukaryotic cells: plasmids, phages, cosmids, fasmids, BAC, YAC.
1.3 Biological systems of molecular biotechnology: bacteria, yeast; higher eukaryotes.
2.DNA introduction into live cells.
2.1 Genetic transformation of prokaryotes.
3.1 Preparation of genomic DNA and cDNA for library construction.
4. Library screening strategies.
4.1 Colony and plaque hybridization.
4.2 Isolation of recombinant vectors and restriction mapping and/or sequencing
5. Polymerase chain reaction (PCR) as an alternative to cell-based DNA cloning.
6. Basic techniques of recombinant DNA technology.
6.1 Isolation of nucleic acids.
6.2 Quantification of nucleic acids (spectrophotometric assay) and DNA sizing from gel.
6.3 Agarose gel electrophoresis.
6.4 Transfer and immobilization of nucleic acids from the gel to a solid support: Southern/Northern blotting.
6.5 Nucleic acid hybridization.
6.6. Production of labeled probes.
6.7 DNA sequencing.
6.8 Making LB agar plates and streaking of bacteria.
6.9 Inoculation of bacterial cultures and preparation of glycerol stocks for long term storage.

Per la comprensione dei contenuti del corso è richiesta una buona conoscenza di Biologia molecolare di base.

In order to understand the contents of the course, students should possess a good knowledge of basic Molecular biology.

Gli studenti dovranno acquisire familiarità con le tecniche più comuni utilizzate per clonare e studiare i geni.

Students are expected to become familiar with the most popular techniques applied in gene cloning.

Modalità didattiche

L'attività didattica consisterà prevalentemente in lezioni di laboratorio. Le lezioni frontali forniranno le conoscenze teoriche delle principali tecniche impiegate in biologia molecolare.

Learning activity will mainly consist of lab experiences. Lectures will be intended to supply the theoretical knowledge of the leading techniques employed in molecular biology.

Obblighi

L'ammissione alla prova di esame è consentita agli studenti che abbiano frequentato almeno i 2/3 delle ore di laboratorio.

Students must attend at least 2/3 of lab hours to be admitted to oral examination.

Testi di studio

• J. W. Dale, M. von Schantz, N. Plant. DAI GENI AI GENOMI, EdiSES, 2013.
• T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2007.
• J. D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski. DNA RICOMBINANTE, Geni e genomi, Zanichelli, 2008.
• H. Kreuzer, A. Massey. BIOLOGIA MOLECOLARE E BIOTECNOLOGIE, Zanichelli, 2010.
• K. Wilson, J. Walker. BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE, Principi e tecniche, Raffaello Cortina Editore, 2006. (Cap. 2, 5, 6, 10).
• D. P. Clark, N. J. Pazdernik. Biotechnology, Academic Cell, Elsevier Inc, 2012.

Altro materiale didattico e articoli scientifici verranno indicati e forniti durante il corso.

Additional educational material or scientific reviews will be made available during the course.

Modalità di
accertamento

Esame orale.

Oral examination.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Modalità didattiche

Le stesse degli studenti frequentanti.

The same as for students attending.

Obblighi

L'ammissione alla prova di esame è consentita agli studenti che abbiano frequentato almeno i 2/3 delle ore di laboratorio.

Students must attend at least 2/3 of lab hours to be admitted to oral examination.

Testi di studio

• J. W. Dale, M. von Schantz, N. Plant. DAI GENI AI GENOMI, EdiSES, 2013.
• T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2007.
• J. D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski. DNA RICOMBINANTE, Geni e genomi, Zanichelli, 2008.
• H. Kreuzer, A. Massey. BIOLOGIA MOLECOLARE E BIOTECNOLOGIE, Zanichelli, 2010.
• K. Wilson, J. Walker. BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE, Principi e tecniche, Raffaello Cortina Editore, 2006. (Cap. 2, 5, 6, 10).
• D. P. Clark, N. J. Pazdernik. Biotechnology, Academic Cell, Elsevier Inc, 2012.

Altro materiale didattico e articoli scientifici verranno indicati e forniti durante il corso.

Additional educational material or scientific reviews will be made available during the course.

Modalità di
accertamento

Esame orale.

Oral examination.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.