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METODOLOGIE BIOCHIMICHE (BIOCHEMICAL METHODOLOGIES)

A.A. CFU
2013/2014 8
Docente Email Ricevimento studenti
Paolino Ninfali lunedì 16-18; student reception time, monday 16-18, Via Saffi 2

Assegnato al Corso di Studio

Scienze biologiche (L-13)
Curriculum: sanitario molecolare , naturalistico (Health molecular naturalistic)
Giorno Orario Aula

Obiettivi Formativi

Il corso intende fornire le nozioni di base relative ai metodi di indagine biochimica, applicati allo studio delle proteine. degli enzimi e dei metaboliti in cellule animali e vegetali. Nelle esperienze di laboratorio gli studenti saranno messi in grado di eseguire un dosaggio enzimatico. purificare una proteina. Fare un gel elettroforetico.  dosare un metabolita.

 

The aims of the course is to provide students with the tools  to understand the methods for the study of proteins (enzymes) and metabolites in animal and vegetable cells. With the lab experiences, the students will be able to assay the activity of an enzyme, to purify a protein and measure the concentration of a metabolite as well as to perform an electrophoresis.

Programma

Il processo scientifico.
Il metodo ipotetico deduttivo, rapporto fra scienza e tecnica, ricaduta sulla società delle scoperte scientifiche e della tecnologia.  Il codice etico nelle ricerche biomediche.
 
Studi in vivo ed ex-vivo.
Utilizzo di animali da esperimento: modificazione della dieta, somministrazione di farmaci, animali transgenici e knoch out. Metodi di studio con cellule ottenuti da tessuti normali e tumorali. Separazione di cellule e organuli sub cellulari: gradiente di densità continuo e isopicnico.
 
Omogenati cellulari.
Lisato di eritrociti (RBC) con tamponi, antiproteolitici, composti riducenti. (con esperienza di laboratorio) Omogenizzazione delle cellule con potter, ultraturrax, sonicazione, omogenizzatori in continuo a pressione.
 
Studio degli enzimi e delle proteine.
Dosaggio dell’attività enzimatica con metodi spettrofotometrici ( con esperienza di laboratorio), fluorimetrici, radiochimici. Cinetica enzimatica: calcolo della Km, Ki, Ka. Studio del tipo di inibizione: competitiva, non competitiva, incompetitiva e mista. Uso degli analoghi dei substrati, effetto del pH e della temperatura.
Quantificazione delle proteine: assorbanza a 280 e 260 nm, metodo del Biureto, di Lowry, di Bradford ( con esperienza di laboratorio). Purificazione delle proteine con tecniche cromatografiche: gel filtrazione, cromatografia a scambio ionico, cromatografia di affinità, cromatografia di immunoaffinità, cromatografia per interazioni idrofobiche, cromatografia a fase inversa. Applicazioni dell’HPLC..
 
 
Elettroforesi. Elettroforesi su gel di poliacrilammide in condizioni native o denaturanti (SDS-PAGE), (con esperienza di laboratorio) tecniche di rivelazione, analisi quantitativa densitometrica delle bande, determinazione del peso molecolare, elettroforesi su gradiente, elettroforesi preparativa, isoelettrofocalizzazione, elettroforesi bidimensionale, western blotting.
 
Dosaggio dei metaboliti. Deproteinizzazione acida o basica. Dosaggio di metaboliti con metodi spettrofotometrici (con esperienza di laboratorio), spettrofluorimetrici, Dosaggio ATP, glucosio. Uso dell’HPLC nel dosaggio dei metaboliti.
 
Tecniche immunologiche.
Produzione di anticorpi policlonali e monoclonali, Purificazione di anticorpi, verifica della immunoreattività, curve di immunotitolazione, applicazioni immunoistochimiche e citochimiche, sistemi ELISA. Metodi radiochimici (RIA).
Spettroscopie avanzate. spettrometria di massa, NMR, EPR, spettroscopia di assorbimento atomico


 ( English version)
 The scientific process: the hypothetic deductive method. The code of ethics for animal and human experimentation.

In vivo studies: diet changes. drug administration, transgenic  and knock-out animals

In Vitro studies: perfused organs, tissue slices, primary cultured cells, immortalized cell lines.

 

Centrifugation techniques. Separations of cells and subcellular organules by isopycnic and differential centrifugation

 

Red Blood cells lysis and preparation of the haemolysates. Buffers and antiproteolitic cocktails, reducing and stabilizing compounds.

Omogenization of tissues by means of potter, ultraturrax. French Press, sonication.

Measurement of enzymatic activity: spectrophotometric. Fluorimetric and radiochemical methods. Determination of the kinetic characteristics: Km. Ki. pH curves. Thermal stability. Protein studies and quantification: absorbance at 280 e 260 nm, method of Bradford. Biureto, Lowry.

Protein purification by conventional chromatography: gel filtration, Ionic exchange, affinity, immunoaffinity. Hydrophobic interactions. High performance liquid chromatography (HPLC) by riverse and direct phase.

Protein primary structure determination by means of the Edman degradation.

Electrophoresis on polyacrylamide gel under native and denaturing conditions (SDS-PAGE), densitometric analysis of the protein bands. Determination of protein molecular weight. Preparative electrophoresis, isoelectrofocusing. 2-D Electrophoresis. Capillary Electrophoresis.

Metabolite assays: deproteinization methods. Assay of metabolites by spectrophotometric. fluorimetric and radiochemical methods.

Advanced spectroscophy: Infra red spectroscopy. NMR, EPR, Mass Spectrometry.

 

Immunochemical techniques: production of monoclonal and plyclonal antibodies, immunotitration curves, immunocytochemical detection of proteins. Direct and indirect ELISA systems. Radiochemical methods (RIA).

 

 

 

Eventuali Propedeuticità

Si richiede l'esame di Biochimica  ; must have passed Biochemistry (second year)

Risultati di Apprendimento (Descrittori di Dublino)

Si farà riferimento ai risultati previsti dai descrittori di Dublino;

 The Dublin Descriptors will be the teaching goals

Attività di Supporto

Si svolgeranno esercitazioni di laboratorio con la collaborazione del Dr Giordano Serafini. Dott.sse Paola Ceccaroli e Roberta Saltarelli. Gli studenti eseguiranno le seguenti esperienze: dosaggio dell’attività di un enzima, dosaggio di un metabolita. Cromatografia. Elettroforesi in SDS. Gli studenti riceveranno protocolli e file in word delle esperienze di laboratorio.

Students will perform the following lab experiments: assay of enzymatic activity and metabolite, purification of a protein, SDS-PAGE with the help of the Dr Giordano Serafini. Dr Paola Ceccaroli e Roberta Saltarelli. The students will receive the protocols of the lab experiments and /or  the electronic file


Modalità Didattiche, Obblighi, Testi di Studio e Modalità di Accertamento

Modalità didattiche

Lezioni frontali, laboratori, esercitazioni di gruppo e test individuali con domande a risposta aperta.

The course will consist of lecturers and lab experiences. Intermediate tests to evaluate the level of  knowledge will be proposed monthly.

Obblighi

Non viene imposto l'obbligo di frequenza ma è vivamente consigliato frequentare le attività pratiche e di laboratorio.

Attendance of lectures is not mandatory, but students are warmly requested to participate in the lab experiences

Testi di studio

 De Marco-Cini “Principi di metodologie biochimiche”, Piccin, 2009;

 

Modalità di
accertamento

Esame orale.

Oral examination (can be either in English or Italian)

Informazioni Aggiuntive per Studenti Non Frequentanti

Modalità didattiche

Prelevare i ppt delle lezioni dalla biblioteca area scientifica, il libro di testo e i protocolli delle esperienze di laboratorio che saranno la premessa indispensabile per sostenere l'esame

Obblighi

Procurarsi e comprendere le esperienze di laboratorio

Testi di studio

 Testo consigliato: De Marco-Cini “Principi di metodologie biochimiche”, Piccin, 2009

 Lezioni teoriche con laboratori ( per i quali e rilasciato il protocollo di lavoro) ed esame orale.

For foreign students the textbook will be agreed with the professor 

Modalità di
accertamento

Esame orale

Note

Lo studente dave procurarsi il materiale indicato nelle precedenti sezioni con largo anticipo prima dell'esame

« torna indietro Ultimo aggiornamento: 02/10/2013


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