Il corso si propone di trasmettere le conoscenze teoriche e le competenze pratiche delle più comuni tecniche di clonaggio del DNA, utilizzate per studiare la struttura e la funzione dei geni (dal DNA alla proteina). Al termine del corso, gli studenti dovranno dimostrare di aver acquisito una buona conoscenza della tecnologia del DNA ricombinante e di essere in grado di progettare e realizzare un esperimento di clonaggio in piena autonomia.

(ENGLISH VERSION)
The goal of this course is to give the basic theoretical notions and practical skills of the most popular DNA cloning techniques used to investigate the structure and function of genes (from DNA to protein). At the end of the course the students are expected to acquire a good knowledge of the recombinant DNA technology and to develop skills in designing and performing a cloning experiment autonomously.

Attività di laboratorio
1. Definizione dell'obiettivo di clonaggio e progettazione della strategia di clonaggio.
1.1 Selezione del gene da clonare e del vettore.
1.2 Selezione degli enzimi di restrizione da utilizzare e progettazione di primer degenerati.
2. Isolamento di RNA totale dalla fonte di partenza selezionata.
2.1 Dosaggio spettrofotometrico e analisi elettroforetica dell'RNA estratto.
3. Sintesi di cDNA da RNA totale, tramite trascrizione inversa (RT).
4. PCR con primer degenerati specifici per l'inserto da clonare.
4.1 Verifica del prodotto di PCR su gel di agaroso.
4.2 Purificazione del prodotto di PCR.
4.3 Digestione del prodotto di PCR con enzimi di restrizione.
5. Ligasi dell'inserto con il vettore pET45b, tagliato con gli stessi enzimi di restrizione (fornito).
6. Trasformazione di cellule E. coli competenti con la reazione di ligasi.
7. Screening e identificazione dei cloni ricombinanti.
7.1 PCR su colonie.
8. Estrazione di un clone con inserto (miniprep DNA plasmidico).
8.1 Linearizzazione a valle dell'inserto con enzimi di restrizione.
9. Preparazione inserto GFP (Green Fluorescent protein) come da punto 4.
10. Ligasi GFP con il vettore ricombinante per ottenere una proteina di fusione.
11. Trasformazione di cellule batteriche ospiti, screening e propagazione.

Lezioni frontali (a supporto delle attività di laboratorio)
1. Clonaggio del DNA: overview su enzimi, vettori, cellule ospiti.
1.1 Enzimi per il clonaggio del DNA: nucleasi, ligasi, polimerasi, fosfatasi.
1.2 Vettori di clonaggio per E. coli e per cellule eucariotiche: plasmidi, fagi, cosmidi, fasmidi, BAC, YAC.
1.3 Sistemi biologici della biotecnologia molecolare: batteri, lieviti, eucarioti superiori.
2. Introduzione di DNA in cellule vive.
2.1 La trasformazione genetica dei procarioti.
3. Genoteche a DNA genomico e a cDNA.
3.1 Preparazione di DNA genomico e di cDNA per la generazione di genoteche.
4. Strategie di screening delle genoteche.
4.1 Colony e plaque hybridization.
4.2 Purificazione di vettori ricombinanti e analisi tramite enzimi di restrizione e/o sequenziamento.
5. Reazione a catena della polimerasi (PCR) come alternativa al clonaggio "cell-based".
6. Tecniche di base della tecnologia del DNA ricombinante.
6.1 Isolamento di acidi nucleici.
6.2 Quantificazione di acidi nucleici: dosaggio spettrofotometrico e sizing da gel.
6.3 Elettroforesi su gel di agaroso.
6.4 Trasferimento e immobilizzazione di acidi nucleici dal gel a un supporto solido: Southern/Northern blotting.
6.5 Ibridazione degli acidi nucleici.
6.6. Produzione di sonde marcate.
6.7 Sequenziamento del DNA.
6.8 Preparazione di piastre di LB agar e streaking di batteri.
6.9 Inoculo di batteri in terreno liquido e preparazione di stock in glicerolo per la conservazione a lungo termine.
7. Introduzione ai vettori di espressione.

(ENGLISH VERSION)
Laboratory experiences
1. Defining the goal of the cloning experiment and design of the cloning strategy.
1.1 Selection of gene to be cloned and vector.
1.2 Selection of restriction enzymes to be used and design of degenerate primers.
2. Isolation of total RNA from the selected source.
2.1 Spectrophotometric quantification and electrophoresis of purified RNA.
3. cDNA synthesis from total RNA, by reverse transcription (RT).
4. PCR with degenerate primers specific for the insert to be cloned.
4.1 Analysis of the amplified product by agarose gel electrophoresis.
4.2 Purification of the PCR product.
4.3 Digestion of PCR product with selected restriction enzymes.
5. Ligase of the insert with the pET45b vector, cut with the same restriction enzymes (provided).
6. Transformation of competent E. coli cells with the ligase reaction.
7. Screening and identification of recombinant clones.
7.1 PCR from bacterial colonies.
8. Extraction of one positive recombinant clone (plasmid miniprep).
8.1 Linearization of the recombinant vector, downstream of the insert, with restriction enzymes.
9. Preparation of GFP (Green Fluorescent Protein) insert as in step 4.
10. Ligase of GFP with the recombinant vector to obtain a fusion protein.
11. Transformation, screening and propagation of host bacterial cells.

Lectures (supporting practical experiences)
1. DNA cloning: overview of enzymes, vectors, host cells.
1.1 Enzymes for DNA cloning: nucleases, ligases, polymerases, phosphatases.
1.2 Cloning vectors for E. coli and eukaryotic cells: plasmids, phages, cosmids, fasmids, BAC, YAC.
1.3 Biological systems of molecular biotechnology: bacteria, yeast; higher eukaryotes.
2.DNA introduction into live cells.
2.1 Genetic transformation of prokaryotes.
3.1 Preparation of genomic DNA and cDNA for library construction.
4. Library screening strategies.
4.1 Colony and plaque hybridization.
4.2 Isolation of recombinant vectors and restriction mapping and/or sequencing
5. Polymerase chain reaction (PCR) as an alternative to cell-based DNA cloning.
6. Basic techniques of recombinant DNA technology.
6.1 Isolation of nucleic acids.
6.2 Quantification of nucleic acids: spectrophotometric assay and sizing from gel.
6.3 Agarose gel electrophoresis.
6.4 Transfer and immobilization of nucleic acids from the gel to a solid support: Southern/Northern blotting.
6.5 Nucleic acid hybridization.
6.6. Production of labeled probes.
6.7 DNA sequencing.
6.8 Making LB agar plates and streaking of bacteria.
6.9 Inoculation of bacterial cultures and preparation of glycerol stocks for long term storage.
7. Introduction to expression vectors.

Per la comprensione dei contenuti del corso è richiesta una buona conoscenza di Biologia molecolare di base.

In order to understand the contents of the course, students should possess a good knowledge of basic Molecular biology.

Gli studenti dovranno acquisire familiarità con le tecniche più comuni utilizzate per clonare e studiare i geni.

Students are expected to become familiar with the most popular techniques applied in gene cloning.

Modalità didattiche

L'attività didattica consisterà prevalentemente in lezioni di laboratorio. Le lezioni frontali forniranno le conoscenze teoriche delle principali tecniche impiegate in biologia molecolare.

Learning activity will mainly consist of lab experiences. Lectures will be intended to supply the theoretical knowledge of the leading techniques employed in molecular biology.

Obblighi

L'ammissione alla prova d'esame è consentita agli studenti che abbiano frequentato almeno i 2/3 delle ore di laboratorio.

Students must attend at least 2/3 of lab hours to be admitted to oral examination.

Testi di studio

• J. W. Dale, M. von Schantz, N. Plant. DAI GENI AI GENOMI, EdiSES, 2013.
• T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2007.
• S. Carson, H. Miller, D. S. Witherow. MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES. A Classroom Laboratory Manual. Pub date: Dec 16, 2011. Elsevier Science & Technology
• J. D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski. DNA RICOMBINANTE, Geni e genomi, Zanichelli, 2008.
• H. Kreuzer, A. Massey. BIOLOGIA MOLECOLARE E BIOTECNOLOGIE, Zanichelli, 2010.
• K. Wilson, J. Walker. BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE, Principi e tecniche, Raffaello Cortina Editore, 2006. (Cap. 2, 5, 6, 10).
• D. P. Clark, N. J. Pazdernik. Biotechnology, Academic Cell, Elsevier Inc, 2012.

Altro materiale didattico e articoli scientifici verranno indicati e forniti durante il corso.

Additional educational material or scientific reviews will be made available during the course.

Modalità di
accertamento

Esame orale; valutazione del quaderno di laboratorio.

Oral examination; lab notebook evaluation.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Modalità didattiche

Le stesse degli studenti frequentanti.

The same as for students attending.

Obblighi

L'ammissione alla prova d'esame è consentita agli studenti che abbiano frequentato almeno i 2/3 delle ore di laboratorio.

Students must attend at least 2/3 of lab hours to be admitted to oral examination.

Testi di studio

• J. W. Dale, M. von Schantz, N. Plant. DAI GENI AI GENOMI, EdiSES, 2013.
• T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2007.
• S. Carson, H. Miller, D. S. Witherow. MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES. A Classroom Laboratory Manual. Pub date: Dec 16, 2011. Elsevier Science & Technology
• J. D. Watson, A.A. Caudy, R.M. Myers, J.A. Witkowski. DNA RICOMBINANTE, Geni e genomi, Zanichelli, 2008.
• H. Kreuzer, A. Massey. BIOLOGIA MOLECOLARE E BIOTECNOLOGIE, Zanichelli, 2010.
• K. Wilson, J. Walker. BIOCHIMICA E BIOLOGIA MOLECOLARE, Principi e tecniche, Raffaello Cortina Editore, 2006. (Cap. 2, 5, 6, 10).
• D. P. Clark, N. J. Pazdernik. Biotechnology, Academic Cell, Elsevier Inc, 2012.

Altro materiale didattico e articoli scientifici verranno indicati e forniti durante il corso.

Additional educational material or scientific reviews will be made available during the course.

Modalità di
accertamento

Esame orale; valutazione del quaderno di laboratorio.

Oral examination; lab notebook evaluation.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

L'esame e la bibliografia potranno essere in lingua inglese su richiesta dello studente.
The student can request to sit the final exam in English with an alternative bibliography.