Il corso si propone di trasmettere le conoscenze teoriche e le competenze pratiche delle tecniche per l’ analisi dell’ espressione genica. Le lezioni in aula forniranno una overview sulle tecniche classiche (tipo Northern Blot) per la rivelazione/misurazione del/degli mRNA fino alle tecniche più moderne (real time/digital qPCR) di accurata quantificazione dei livelli dell’espressione del singolo/i gene. Saranno prese in considerazione la tecnica di microarray e di RNA-Seq (basate su sequenziamento NGS)  per la valutazione dei differenti profili di espressione genica (trascrittoma). Durante le lezioni di laboratorio sarà messa in pratica una strategia sperimentale finalizzata alla valutazione dei livelli di espressione di potenziali geni target coinvolti in un dato processo fisiologico o patologico che dovranno essere normalizzati rispetto ai livelli di espressione di geni di riferimento. Per ottenere analisi e conclusioni biologicamente significative di espressione genica si utilizzeranno test statistici opportuni.

Lezioni frontali (a supporto delle attività di laboratorio)

1. Organizzazione dei laboratori/lavoro per una corretta sperimentazione in biologia molecolare.
1.1 Suddivisione degli ambienti di lavoro e delle attività svolte.
1.2 Standard Operating Procedure.
1.3 Workflow.

2. Preparazione e conservazione dei campioni biologici per l’analisi degli acidi nucleici.

3. Principali calcoli utilizzati nei laboratori biologia molecolare (biochimica).

4. Sistemi di quantificazione degli acidi nucleici.
4.1 Metodo spettrofotometrico. NanoDrop 1000.
4.2 Metodo colorimetrico.
4.3. Metodo fluorimetrico.

5.Estrazione di RNA dalle cellule.
5.1 Manipolazione/precauzioni RNA. Prevenzione contaminazioni RNasi endogene.
5.2 Scelta del metodo (classica o kit commerciali) opportuno.
5.3 Fasi principali dell’isolamento di RNA da varie matrici.

6. Analisi qualitativa dell’RNA.
6.1 Elettroforesi su gel denaturante d’agarosio.
6.2 Bioanalyzer RNA.

7. Purificazione mRNA.
7.1 Cromatografia di affinità per la separazione di RNA poli(A)+.

8. Strategie di sintesi di cDNA.

9. Tecniche di trasferimento su membrana.
9.1 Applicazioni della tecnica di Northern Blot associata alla tecnica di ibridazione.
9.2 Marcatura della sonda.
9.3 Procedura d’ibridazione.
9.4 Dot blot.

10. Reverse Transcriptase PCR.
10.1 One step PCR.
10.2 Two step PCR.

11. Metodica di PCR (1° parte).
11.1 Caratteristiche.
11.2 Teoria

12. Metodica di PCR (2° parte).
12.1 Ottimizzazione.

13.Tipi di PCR.
13.1 Long PCR.
13.2 Nested PCR.
13.3 Multiplex PCR.
13.4 Cloning DNA attraverso PCR.
13.5 Mutagenesi tramite PCR.

14. PCR semi-quantitativa.
14.1 Caratteristiche.
14.2 Esempi.

15. Real-time PCR.

Attività di laboratorio

1. Definizione dell'obiettivo dell’analisi dell’espressione genica e progettazione della strategia di lavoro.

2. Selezione del/dei migliore gene nousekeeping.

3. Valutazione dell'analisi dell'espressione dei geni d'interesse.

4. Isolamento di RNA totale dalla matrice selezionata.

5. Dosaggio spettrofotometrico.

6. Sintesi di cDNA da RNA totale, tramite trascrizione inversa (RT).

7. Diluizioni, allestimento delle reazioni di qPCR.

8. Analisi dei dati con metodi statistici opportuni.

9. Report finale/tesina.

Per la comprensione dei contenuti del corso è richiesta una buona conoscenza di Biologia Molecolare di base.

Conoscenza e capacità di comprensione. Gli studenti dovranno dimostrare di avere acquisito le conoscenze teorico-pratiche delle tecniche sperimentali affrontate durante il corso e saper organizzare la parte esperimentale e flusso di lavoro inerente ad uno studio di espressione genica. Gli studenti dovranno infine saper elaborare un’opportuna analisi dei risultati per comprenderne il significato biologico.

Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Gli studenti dovranno dimostrare di avere padronanza delle metodologie trattate durante il corso e di valutare il loro utilizzo in un contesto sperimentale, di sviluppare e mettere in pratica un corretto disegno sperimentale relativo ad analisi di espressione genica e valutarne il significato biologico.

Autonomia di giudizio. Gli studenti dovranno essere in grado di valutare e applicare le conoscenze metodologiche ottenute durante il corso ed essere in grado di elaborare autonomamente i risultati ottenuti nella fase sperimentale.

Abilità comunicative.  Gli studenti dovranno dimostrare di saper spiegare in maniera semplice e corretta, con linguaggio scientifico adeguato e critico gli argomenti trattati durante le lezioni ed in laboratorio.

Capacità di apprendimento. Gli studenti dovranno dimostrare di avere la capacità di reperire autonomamente le pubblicazioni scientifiche inerenti al corso, e la capacità di migliorare la propria conoscenza teorico-pratica nell’ambito delle tecnologie di analisi dei profili di espressione genica.

Il materiale didattico predisposto dalla/dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni della/del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it

Modalità didattiche

Il corso si svolgerà mediante lezioni frontali nelle quali saranno fornite le conoscenze teoriche delle principali tecniche impiegate in biologia molecolare e più specificatamente relative alla valutazione dei profili di espressione genica. Per quanto riguarda l’attività sperimentale gli studenti organizzeranno il flusso di lavoro con il docente e svolgeranno autonomamente ogni fase sperimentale. Infine analizzeranno i dati tramite analisi statistica e organizzeranno e rappresenteranno i risultati tramite grafici e/o tabelle per una miglior lettura dei dati ottenuti. Il calendario delle lezioni di laboratorio sarà stabilito all'inizio del corso.

Obblighi

Per poter frequentare i laboratori é obbligatorio avere seguito e superato il test finale del Corso di Formazione Generale sulla Sicurezza per i Lavoratori e del Corso sulla Sicurezza nel Laboratorio Chimico e Biologico.

Testi di studio

Materiale didattico di studio verrà fornito dal docente durante lo svolgimento del corso.

R. J. Reece. ANALISI DEI GENI E DEI GENOMI, EDISES, 2011.

T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2017.

Modalità di
accertamento

Ai fini dell’accertamento della preparazione lo studente dovrà sostenere una prova orale (4 domande) finalizzata a verificare la comprensione dei diversi argomenti del programma, il grado di approfondimento e la capacità dello studente di collegare diverse tematiche fra di loro e di risolvere problemi pratici. Per la valutazione del lavoro svolto in laboratorio, lo studente dovrà organizzare ed esporre i risultati ottenuti in una presentazione orale, tramite tool come Power Point di circa 20 minuti. Particolare attenzione sarà rivolta anche alla qualità del linguaggio scientifico dell’esposizione orale.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Modalità didattiche

Il corso si svolgerà mediante lezioni frontali nelle quali saranno fornite le conoscenze teoriche delle principali tecniche impiegate in biologia molecolare e più specificatamente relative alla valutazione dei profili di espressione genica. Per quanto riguarda l’attività sperimentale gli studenti organizzeranno il flusso di lavoro con il docente e svolgeranno autonomamente ogni fase sperimentale. Infine analizzeranno i dati tramite analisi statistica e organizzeranno e rappresenteranno i risultati tramite grafici e/o tabelle per una miglior lettura dei dati ottenuti.  Il calendario delle lezioni di laboratorio sarà stabilito all'inizio del corso.

Obblighi

Per poter frequentare i laboratori é obbligatorio avere seguito e superato il test finale del Corso di Formazione Generale sulla Sicurezza per i Lavoratori e del Corso sulla Sicurezza nel Laboratorio Chimico e Biologico.

Testi di studio

Materiale didattico di studio verrà fornito dal docente durante lo svolgimento del corso.

R. J. Reece. ANALISI DEI GENI E DEI GENOMI, EDISES, 2011.

T. A. Brown. BIOTECNOLOGIE MOLECOLARI, Principi e tecniche, Zanichelli, 2017.

Modalità di
accertamento

Ai fini dell’accertamento della preparazione lo studente dovrà sostenere una prova orale (4 domande) finalizzata a verificare la comprensione dei diversi argomenti del programma, il grado di approfondimento e la capacità dello studente di collegare diverse tematiche fra di loro e di risolvere problemi pratici. Per la valutazione del lavoro svolto in laboratorio, lo studente dovrà organizzare ed esporre i risultati ottenuti in una presentazione orale, tramite tool come Power Point di circa 20 minuti. Particolare attenzione sarà rivolta anche alla qualità del linguaggio scientifico dell’esposizione orale.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.