Il corso si propone di illustrare e di trasmettere agli studenti i principi e le applicazioni delle tecniche biochimiche per lo studio dell’espressione, la produzione in forma ricombinante, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Le proteine sono importanti bersagli di intervento farmacologico, ma sono anche ampiamente utilizzate come biofarmaci, nello sviluppo di diagnostici, nonché come biocatalizzatori ed enzimi tecnici in ambito industriale. Pertanto, l’apprendimento delle metodologie inerenti alla biochimica delle proteine e le tecniche del DNA ricombinante è parte integrane del percorso formativo di figure con competenze chimiche, farmacologiche e tecnologiche.

1.     Introduzione allo studio delle proteine

Richiami sulla struttura delle proteine. Folding proteico. Modificazioni post traduzionali. Comparti intracellulari e smistamento delle proteine

2.     Modelli in vitro, ex-vivo e in vivo per lo studio delle proteine

2.1  Colture cellulari: strumentazione di base; terreni di coltura, propagazione e stoccaggio; colture cellulari primarie e linee cellulari immortalizzate e tumorali

2.2  Organi e organoidi, topi transgenici e topi knock out (cenni)

3.     Tecniche di analisi e manipolazione dell’espressione genica

3.1 Tecniche di estrazione del DNA e RNA, PCR, Real Time PCR, microarray.

3.2 Cenni sulle tecniche di manipolazione dell’espressione genica (antisenso, decoy, siRNA, CRISP-Cas9)

4.     Metodi di lisi cellulare e disgregazione tissutale

4.1 Metodi fisici, meccanici e chimici.

4.2 Formulazione del tampone di estrazione

4.3 Tecniche centrifugative e frazionamento cellulare.

5.     Metodi di dosaggio delle proteine

Idrolisi acida e metodi spettrofotometrici (280 nm, Bradford, Lowry, BCA)

6.     Tecniche di analisi delle proteine

6.1 Tecniche elettroforetiche:

6.1.1 Aspetti fisici della separazione elettroforetica. Gel di poliacrilammide. SDS-PAGE. Sistema gel/tampone di tipo continuo e discontinuo. Metodi di colorazione. 

6.1.2 PAGE in condizioni native.

6.1.3 Isoelettrofocalizzazione e separazioni bidimensionali

6.2 Tecniche immunochimiche.

6.2.1 Produzione di anticorpi mono- e policlonali, strategie di immunizzazione, tecniche di purificazione delle immunoglobuline

6.2.2 Western immunoblotting: bloccaggio; rilevazione diretta e indiretta; marcatura degli anticorpi e metodi di rilevazione.

6.2.3 Tecniche ELISA (diretto, indiretto semplice e sandwich, competitivo)

6.3 Gli approcci proteomici basati sulla spettrometria di massa

6.4 Dosaggi enzimatici

6.4.1 Richiami di cinetica enzimatica; valutazione sperimentale della cinetica allo stato stazionario: misura della velocità iniziale, reazioni enzimatiche a singolo substrato, reazioni enzimatiche a due substrati, inibitori enzimatici.

6.4.2 Metodi spettrofotometrici, spettrofluorimetrici e in luminescenza.

6.4.3 Dosaggio del substrato.

7.     Metodi di purificazione delle proteine

7.1 Tecniche di chiarificazione dell'estratto cellulare

7.2 Richiamo delle principali tecniche cromatografiche.

7.3 Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione; sviluppo di un saggio specifico; selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento; resa e grado di purificazione.

7.4 Dialisi, ultrafiltrazione, liofilizzazione e stoccaggio.

8.     La tecnologia del DNA ricombinante per la produzione di proteine

8.1  Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti

8.2  Escherichia coli come sistema di espressione.

8.2.1 Vettori di clonaggio e di espressione plasmidici, sito multiplo di clonaggio e codon usage, origine di replicazione e copie plasmidiche, I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, ptac, pL,T7, pBAD), I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi, Il Ribosome Binding Site.

8.2.2  Strategie per prevenire la proteolisi in vivo: proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare, manipolazione delle condizioni di fermentazione, ingegnerizzazione dell'ospite, ingegnerizzazione del prodotto.

8.2.3   Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione: la formazione dei corpi di inclusione; manipolazione delle condizioni di fermentazione; ingegnerizzazione dell'ospite; ingegnerizzazione del prodotto. La secrezione nel periplasma. Le proteine di fusione (MBP, GST, UB, SUMO). Uso delle proteasi per la rimozione del partner di fusione e i peptidi autotaglianti. 

8.2.4 Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione e  applicazioni biotecnologiche dei corpi di inclusione.

8.5  Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche.

8.5.1 Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici (test del coniglio, test del Limulus Amoebocyte Lysate, test ricombinanti, MAT test)

8.5.2 Tecniche di eliminazione dei contaminanti endotossinici.

9.  La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione

La matrice, Il ligando, Il braccio spaziatore. Tecniche di eluizione. Ligandi biologici e strutturali utilizzati per la purificazione di proteine ricombinanti.

10.  Caratteristiche degli altri sistemi di espressione

  Lieviti, cellule di mammifero, cellule di insetto, le piante: vantaggi e svantaggi

11.  Esempi di proteine ricombinanti utilizzate come biofarmaci ed enzimi industriali

nessuna

D1-Conoscenza e capacità di comprensione. Lo studente dovrà dimostrare di conoscere le metodologie biochimiche e molecolari utilizzate per l’analisi di espressione, isolamento, identificazione e caratterizzazione di proteine, incluse le proteine ricombinanti. Dovrà inoltre conoscere e comprendere le potenzialità delle proteine in ambito farmacologico, diagnostico e industriale.

D2-Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Lo studente dovrà essere in grado di selezionare le tecniche più appropriate per risolvere problemi specifici in contesti diversi che vanno dalla ricerca di base alla produzione industriale.

D3-Autonomia di giudizio. Lo studente dovrà dimostrare di sapere argomentare le scelte metodologiche sulla base dei limiti associati alle varie tecniche studiate, proponendo soluzioni alternative o analisi integrative.

D4-Abilità comunicative. Lo studente dovrà essere in grado di esprimersi in un linguaggio appropriato utilizzando la terminologia tecnica del settore. Dovrà inoltre essere in grado di fare rimandi ad argomenti affini in maniera logica.

D5-Capacità di apprendimento. Lo studente dovrà essere in grado di leggere autonomamente e criticamente la letteratura di settore, approfondendo gli aspetti di interesse. Lo studente dovrà essere in grado di porre domande e fornire risposte.

Il materiale didattico predisposto dalla/dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni della/del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it

non previste

Modalità didattiche

Lezioni frontali avvalendosi di diapositive e video tutorial dalla piattaforma JoVe per l'illustrazione della parte pratica

1 CFU di laboratorio con suddivisione in 2 gruppi (retta di calibrazione della BSA con metodo Bradford; lisi batterica e dosaggio della glutatione S-transferasi)

Obblighi

nessuno

Testi di studio

M. Duranti. Introduzione allo studio delle proteine. Zanichelli 

K. Wilson, J. Walzer. Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio. Raffaello Cortina Editore.

B.R. Glick, J.J. Pasternak. Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante. Zanichelli.

M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo. Metodologie Biochimiche - Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Casa Editrice Ambrosiana.
 

Modalità di
accertamento

Colloquio orale. Verranno poste allo studente almeno tre domande per verificare il livello di conoscenza ed approfondimento degli argomenti del programma del corso e la capacità di ragionamento sviluppata dallo studente nell’affrontare problematiche specifiche inerenti la biochimica delle proteine.

Concorrono a determinare il voto: il livello di padronanza delle nozioni teoriche e la capacità di applicarle ad esempi concreti, il livello di articolazione e la pertinenza delle risposte, la proprietà di linguaggio, incluso l'utilizzo di terminologia tecnica appropriata, la capacità di esposizione.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Modalità didattiche

Per dare la possibilità alle studentesse e agli studenti non frequentanti di compensare con lo studio autonomo quanto è svolto durante le lezioni, sono indicati i seguenti materiali riferiti ai medesimi contenuti del programma ai fini di promuoverne la piena comprensione:

selezione di video su alcune tematiche trattate corredati da quiz di autovalutazione. Il link ai video e ai quiz sarà fornito sulla piattaforma Moodle. 

Obblighi

nessuno

Testi di studio

M. Duranti. Introduzione allo studio delle proteine. Zanichelli

K. Wilson, J. Walzer. Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio. Raffaello Cortina Editore.

B.R. Glick, J.J. Pasternak. Biotecnologia Molecolare, Principi e Applicazioni del DNA Ricombinante. Zanichelli.

M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo. Metodologie Biochimiche - Principi e tecniche per l'espressione, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Casa Editrice Ambrosiana.

Modalità di
accertamento

Colloquio orale. Verranno poste allo studente almeno tre domande per verificare il livello di conoscenza ed approfondimento degli argomenti del programma del corso e la capacità di ragionamento sviluppata dallo studente nell’affrontare problematiche specifiche inerenti la biochimica delle proteine.

Concorrono a determinare il voto: il livello di padronanza delle nozioni teoriche e la capacità di applicarle ad esempi concreti, il livello di articolazione e la pertinenza delle risposte, la proprietà di linguaggio, incluso l'utilizzo di terminologia tecnica appropriata, la capacità di esposizione.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.