Il corso si propone di illustrare e di trasmettere agli studenti i principi e le applicazioni delle tecniche biochimiche per lo studio dell’espressione, la produzione in forma ricombinante, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Le proteine sono importanti bersagli di intervento farmacologico, ma sono anche ampiamente utilizzate come biofarmaci, nello sviluppo di diagnostici, nonché come biocatalizzatori ed enzimi tecnici in ambito industriale. Pertanto, l’apprendimento delle metodologie inerenti alla biochimica delle proteine e le tecniche del DNA ricombinante è parte integrane del percorso formativo di figure con competenze chimiche, farmacologiche e tecnologiche.

Introduzione allo studio delle proteine

Richiami sulla struttura delle proteine

Folding proteico

Modificazioni post traduzionali

Comparti intracellulari e smistamento delle proteine

Modelli sperimentali per lo studio delle proteine

Colture cellulari: strumentazione di base; terreni di coltura, propagazione e stoccaggio

Colture cellulari primarie, linee cellulari immortalizzate e tumorali, organoidi e sferoidi

Topi transgenici e topi knock out (cenni)

Metodi di lisi cellulare, disgregazione tissutale, frazionamento cellulare

Metodi fisici, meccanici e chimici.

Formulazione del tampone di estrazione

Tecniche centrifugative e frazionamento cellulare.

Metodi di dosaggio delle proteine

Idrolisi acida

Spettroscopia di assorbimento UV/VIS

Metodi spettrofotometrici (280 nm, Bradford, Lowry, BCA)

Spettroscopia di fluorescenza

Metodi fluorimetrici

Tecniche di analisi e manipolazione dell’espressione genica

Tecniche di estrazione del RNA, quantificazione, Real Time PCR, microarray

Tecniche di manipolazione dell’espressione genica (antisenso, decoy, siRNA, CRISP-Cas9)

Tecniche elettroforetiche (RNA e proteine)

Aspetti fisici della separazione elettroforetica. Gel di agarosio e di poliacrilammide.

SDS-PAGE. Sistema gel/tampone di tipo continuo e discontinuo. Metodi di colorazione

PAGE in condizioni native

Isoelettrofocalizzazione e separazioni bidimensionali

Tecniche immunochimiche

Produzione di anticorpi mono- e policlonali, strategie di immunizzazione, tecniche di purificazione delle immunoglobuline

Western immunoblotting: bloccaggio; rilevazione diretta e indiretta; marcatura degli anticorpi e metodi di rilevazione.

Tecniche ELISA (diretto, indiretto semplice e sandwich, competitivo)

Tecniche cromatografiche

Cromatografia a scambio ionico

Cromatografia di ripartizione

Cromatografia a esclusione molecolare

Cromatografia di affinità

Cromatografia idrofobica

FPLC e HPLC

Enzimi

Dosaggi enzimatici

Richiami di cinetica enzimatica; valutazione sperimentale della cinetica allo stato stazionario: misura della velocità iniziale, reazioni enzimatiche a singolo substrato, reazioni enzimatiche a due substrati, inibitori enzimatici.

Dosaggio del substrato.

La tecnologia del DNA ricombinante per la produzione di proteine

Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti

Escherichia coli come sistema di espressione

Vettori di clonaggio e di espressione plasmidici, sito multiplo di clonaggio e codon usage, origine di replicazione e copie plasmidiche, I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, ptac, pL T7, pBAD), I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi, Il Ribosome Binding Site

Strategie per prevenire la proteolisi in vivo

Proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare

Manipolazione delle condizioni di fermentazione, ingegnerizzazione dell'ospite, ingegnerizzazione del prodotto.

Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione:

La formazione dei corpi di inclusione

Manipolazione delle condizioni di fermentazione

Ingegnerizzazione dell'ospite (coespressione con chaperon molecolari; i ceppi ossidanti)

Ingegnerizzazione del prodotto (la secrezione nel periplasma. le proteine di fusione con MBP, GST, SUMO). Uso delle proteasi per la rimozione del partner di fusione e i peptidi autotaglianti).

Downstream processing

Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione e applicazioni biotecnologiche dei corpi di inclusione.

Tecniche di chiarificazione dell'estratto cellulare

Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione; sviluppo di un saggio specifico; selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento; resa e grado di purificazione.

La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione (ligandi biologici e strutturali)

Dialisi, ultrafiltrazione, liofilizzazione e stoccaggio.

Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche.

Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici (test del coniglio, test del Limulus Amoebocyte Lysate, test ricombinanti, MAT test)

Tecniche di eliminazione dei contaminanti endotossinici.

Esempi di proteine ricombinanti utilizzate come biofarmaci ed enzimi industriali

nessuna

D1-Conoscenza e capacità di comprensione. Lo studente dovrà dimostrare di conoscere le metodologie biochimiche e molecolari utilizzate per l’analisi di espressione, isolamento, identificazione e caratterizzazione di proteine, incluse le proteine ricombinanti. Dovrà inoltre conoscere e comprendere le potenzialità delle proteine in ambito farmacologico, diagnostico e industriale.

D2-Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Lo studente dovrà essere in grado di selezionare le tecniche più appropriate per risolvere problemi specifici in contesti diversi che vanno dalla ricerca di base alla produzione industriale.

D3-Autonomia di giudizio. Lo studente dovrà dimostrare di sapere argomentare le scelte metodologiche sulla base dei limiti associati alle varie tecniche studiate, proponendo soluzioni alternative o analisi integrative.

D4-Abilità comunicative. Lo studente dovrà essere in grado di esprimersi in un linguaggio appropriato utilizzando la terminologia tecnica del settore. Dovrà inoltre essere in grado di fare rimandi ad argomenti affini in maniera logica.

D5-Capacità di apprendimento. Lo studente dovrà essere in grado di leggere autonomamente e criticamente la letteratura di settore, approfondendo gli aspetti di interesse. Lo studente dovrà essere in grado di porre domande e fornire risposte.

Il materiale didattico predisposto dalla/dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni della/del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it

non previste

Modalità didattiche

Lezioni frontali avvalendosi di diapositive e video tutorial dalla piattaforma JoVe per l'illustrazione della parte pratica

Obblighi

nessuno

Testi di studio

Testi di studio

M. Duranti. Introduzione allo studio delle proteine. Zanichelli 

M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo. Metodologie Biochimiche - Espressione, purificazione e caratterizzazione delle proteine. Zanichelli

Testi di consultazione

M. Maccarone. Metodologie biochimiche e biomolecolari. Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio. Zanichelli

K. Wilson, J. Walzer. Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio. Raffaello Cortina Editore.

Modalità di
accertamento

Colloquio orale. Verranno poste allo studente almeno tre domande per verificare il livello di conoscenza ed approfondimento degli argomenti del programma del corso e la capacità di ragionamento sviluppata dallo studente nell’affrontare problematiche specifiche inerenti la biochimica delle proteine.

Concorrono a determinare il voto: il livello di padronanza delle nozioni teoriche e la capacità di applicarle ad esempi concreti, il livello di articolazione e la pertinenza delle risposte, la proprietà di linguaggio, incluso l'utilizzo di terminologia tecnica appropriata, la capacità di esposizione.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Modalità didattiche

Per dare la possibilità alle studentesse e agli studenti non frequentanti di compensare con lo studio autonomo quanto è svolto durante le lezioni, sono indicati i seguenti materiali riferiti ai medesimi contenuti del programma ai fini di promuoverne la piena comprensione:

selezione di video su alcune tematiche trattate corredati da quiz di autovalutazione. Il link ai video e ai quiz sarà fornito sulla piattaforma Moodle. 

Obblighi

nessuno

Testi di studio

Testi di studio

M. Duranti. Introduzione allo studio delle proteine. Zanichelli 

M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo. Metodologie Biochimiche - Espressione, purificazione e caratterizzazione delle proteine. Zanichelli

Testi di consultazione

M. Maccarone. Metodologie biochimiche e biomolecolari. Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio. Zanichelli

K. Wilson, J. Walzer. Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio. Raffaello Cortina Editore.

Modalità di
accertamento

Colloquio orale. Verranno poste allo studente almeno tre domande per verificare il livello di conoscenza ed approfondimento degli argomenti del programma del corso e la capacità di ragionamento sviluppata dallo studente nell’affrontare problematiche specifiche inerenti la biochimica delle proteine.

Concorrono a determinare il voto: il livello di padronanza delle nozioni teoriche e la capacità di applicarle ad esempi concreti, il livello di articolazione e la pertinenza delle risposte, la proprietà di linguaggio, incluso l'utilizzo di terminologia tecnica appropriata, la capacità di esposizione.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.