Il corso si propone di illustrare e di trasmettere agli studenti i principi e le applicazioni delle tecniche biochimiche per lo studio dell’espressione, la produzione in forma ricombinante, la purificazione e la caratterizzazione delle proteine. Le proteine sono importanti bersagli di intervento farmacologico, ma sono anche ampiamente utilizzate come biofarmaci, nello sviluppo di diagnostici, nonché come biocatalizzatori ed enzimi tecnici in ambito industriale. Pertanto, l’apprendimento delle metodologie inerenti alla biochimica delle proteine e le tecniche del DNA ricombinante è parte integrane del percorso formativo di figure con competenze chimiche, farmacologiche e tecnologiche.

1. Introduzione allo studio delle proteine

1.1 Richiami sulla struttura delle proteine

1.2 Folding proteico

1.3 Modificazioni post traduzionali

1.4 Comparti intracellulari e smistamento delle proteine

1.5 Degradazione delle proteine

2. Modelli sperimentali per lo studio delle proteine

2.1 Colture cellulari: strumentazione di base; terreni di coltura, propagazione e stoccaggio

2.2 Colture cellulari primarie, linee cellulari immortalizzate e tumorali, organoidi e sferoidi

2.3 Topi transgenici, topi knock in, topi knock out e knock out condizionali (sistema Cre-Lox)

3. Metodi di lisi cellulare, disgregazione tissutale, frazionamento cellulare

3.1 Metodi fisici, meccanici e chimici.

3.2 Formulazione del tampone di estrazione

3.3 Tecniche centrifugative e frazionamento cellulare.

4. Metodi di dosaggio delle proteine

4.1 Spettroscopia di assorbimento UV/VIS

4.2 Metodi spettrofotometrici per il dosaggio delle proteine (280 nm, Bradford, Lowry, BCA)

4.3 Costruzione della retta di calibrazione della BSA con metodo Bradford

4.4 Spettroscopia di fluorescenza

4.5 Metodi spettrofluorimetrici per il dosaggio delle proteine

4.6 Metodi basati sull'analisi degli aminoacidi

5. Tecniche di analisi dell’espressione genica

5.1 Tecniche di estrazione del RNA e quantificazione

5.2 Real Time PCR

5.3 Microarray

6. Tecniche elettroforetiche (RNA e proteine)

6.1 Aspetti fisici della separazione elettroforetica. 

6.2 Gel di poliacrilammide

6.3 SDS-PAGE. Sistema gel/tampone di tipo continuo e discontinuo.

6.4 Metodi di colorazione

6.5 PAGE in condizioni native

6.6 Isoelettrofocalizzazione e separazioni bidimensionali

6.7 Gel di agarosio per l'analisi di DNA e RNA

7. Tecniche immunochimiche

7.1 Produzione di anticorpi mono- e policlonali, strategie di immunizzazione, tecniche di purificazione delle immunoglobuline

7.2 Western immunoblotting: bloccaggio; rilevazione diretta e indiretta; marcatura degli anticorpi e metodi di rilevazione.

7.3 Immonocromatografia

7.4 Tecniche ELISA (diretto, indiretto semplice e sandwich, competitivo)

8. La tecnologia del DNA ricombinante per la produzione di proteine

8.1 Scopi dell'espressione di proteine ricombinanti

8.2 Escherichia coli come sistema di espressione

8.3 Vettori di clonaggio e di espressione plasmidici, sito multiplo di clonaggio e codon usage, origine di replicazione e copie plasmidiche, I promotori forti e regolabili (promotore lac, triptofano, ptac, pL T7, pBAD), I geni di resistenza agli antibiotici e i marcatori recessivi, Il Ribosome Binding Site

9. Strategie per prevenire la proteolisi in vivo

9.1 Proteasi batteriche e loro localizzazione intracellulare

9.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione, ingegnerizzazione dell'ospite, ingegnerizzazione del prodotto.

10. Strategie per prevenire la formazione dei corpi di inclusione:

10.1 La formazione dei corpi di inclusione

10.2 Manipolazione delle condizioni di fermentazione

10.3 Ingegnerizzazione dell'ospite (coespressione con chaperon molecolari; i ceppi ossidanti)

10.4 Ingegnerizzazione del prodotto (la secrezione nel periplasma. le proteine di fusione con MBP, GST, SUMO). Uso delle proteasi per la rimozione del partner di fusione e i peptidi autotaglianti).

11. Downstream processing

11.1 Recupero di proteine bioattive dai corpi di inclusione e applicazioni biotecnologiche dei corpi di inclusione.

11.2 Tecniche di chiarificazione dell'estratto cellulare

11.3 Cenni sulle principali tecniche cromatografiche

11.4 La cromatografia di affinità applicata alla purificazione delle proteine di fusione (ligandi biologici e strutturali)

11.5 Fasi e obiettivi di un protocollo di purificazione; sviluppo di un saggio specifico; selezione e combinazione delle tecniche di frazionamento ; resa e grado di purificazione.

11.6 Dialisi, ultrafiltrazione, liofilizzazione e stoccaggio.

12. Endotossine batteriche: struttura e implicazioni cliniche.

12.1 Tecniche di rilevazione di contaminanti endotossinici (test del coniglio, test del Limulus Amoebocyte Lysate, test ricombinanti, MAT test)

12.2 Tecniche di eliminazione dei contaminanti endotossinici.

nessuna

D1-Conoscenza e capacità di comprensione. Lo studente dovrà dimostrare di conoscere le metodologie biochimiche e molecolari utilizzate per l’analisi di espressione, isolamento, identificazione e caratterizzazione di proteine, incluse le proteine ricombinanti. Dovrà inoltre conoscere e comprendere le potenzialità delle proteine in ambito farmacologico, diagnostico e industriale.

D2-Capacità di applicare conoscenza e comprensione. Lo studente dovrà essere in grado di selezionare le tecniche più appropriate per risolvere problemi specifici in contesti diversi che vanno dalla ricerca di base alla produzione industriale.

D3-Autonomia di giudizio. Lo studente dovrà dimostrare di sapere argomentare le scelte metodologiche sulla base dei limiti associati alle varie tecniche studiate, proponendo soluzioni alternative o analisi integrative.

D4-Abilità comunicative. Lo studente dovrà essere in grado di esprimersi in un linguaggio appropriato utilizzando la terminologia tecnica del settore. Dovrà inoltre essere in grado di fare rimandi ad argomenti affini in maniera logica.

D5-Capacità di apprendimento. Lo studente dovrà essere in grado di leggere autonomamente e criticamente la letteratura di settore, approfondendo gli aspetti di interesse. Lo studente dovrà essere in grado di porre domande e fornire risposte.

Il materiale didattico predisposto dalla/dal docente in aggiunta ai testi consigliati (come ad esempio diapositive, dispense, esercizi, bibliografia) e le comunicazioni della/del docente specifiche per l'insegnamento sono reperibili all'interno della piattaforma Moodle › blended.uniurb.it

non previste

Modalità didattiche

Lezioni frontali avvalendosi di diapositive e video tutorial dalla piattaforma JoVe per l'illustrazione della parte pratica

Obblighi

nessuno

Testi di studio

Testi di studio

M. Duranti. Introduzione allo studio delle proteine. Zanichelli 

M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo. Metodologie Biochimiche - Espressione, purificazione e caratterizzazione delle proteine. Zanichelli

Testi di consultazione

M. Maccarone. Metodologie biochimiche e biomolecolari. Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio. Zanichelli

K. Wilson, J. Walzer. Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio. Raffaello Cortina Editore.

Modalità di
accertamento

Esame scritto in cui sarà chiesto agli studenti di esporre tre delle quattro tematiche proposte dal docente. I quesiti sono atti a verificare il livello di conoscenza ed approfondimento degli argomenti del programma del corso nonché la capacità di selezionare le tecniche più appropriate per affrontare problematiche specifiche inerenti la biochimica delle proteine.

Ad ogni risposta saranno assegnati da 0 a 10 punti. Il voto finale sarà stabilito sommando il punteggio totale espresso in trentesimi.

Concorrono a determinare il voto: il livello di padronanza delle nozioni teoriche, il livello di articolazione e la pertinenza delle risposte, la proprietà di linguaggio, incluso l'utilizzo di terminologia tecnica appropriata, la capacità di esposizione.

La prova si considera superata se il voto riportato nello scritto è di almeno 18/30.

Gli studenti che abbiano riportato nella prova scritta almeno 18/30 e desiderano sostenere anche l'esame orale potranno contattare il docente per il colloquio integrativo. La data dell'esame orale sarà comunicata dal docente tramite blended.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Modalità didattiche

Per dare la possibilità alle studentesse e agli studenti non frequentanti di compensare con lo studio autonomo quanto è svolto durante le lezioni, sono indicati i seguenti materiali riferiti ai medesimi contenuti del programma ai fini di promuoverne la piena comprensione:

selezione di video sulle tematiche trattate. Il link ai video sarà fornito sulla piattaforma Moodle. 

Obblighi

nessuno

Testi di studio

Testi di studio

M. Duranti. Introduzione allo studio delle proteine. Zanichelli 

M. C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M. L. Di Salvo. Metodologie Biochimiche - Espressione, purificazione e caratterizzazione delle proteine. Zanichelli

Testi di consultazione

M. Maccarone. Metodologie biochimiche e biomolecolari. Strumenti e tecniche per il laboratorio del nuovo millennio. Zanichelli

K. Wilson, J. Walzer. Metodologia Biochimica, le Bioscienze e le Biotecnologie in Laboratorio. Raffaello Cortina Editore.

Modalità di
accertamento

Esame scritto in cui sarà chiesto agli studenti di esporre tre delle quattro tematiche proposte dal docente. I quesiti sono atti a verificare il livello di conoscenza ed approfondimento degli argomenti del programma del corso nonché la capacità di selezionare le tecniche più appropriate per affrontare problematiche specifiche inerenti la biochimica delle proteine.

Ad ogni risposta saranno assegnati da 0 a 10 punti. Il voto finale sarà stabilito sommando il punteggio totale espresso in trentesimi.

Concorrono a determinare il voto: il livello di padronanza delle nozioni teoriche, il livello di articolazione e la pertinenza delle risposte, la proprietà di linguaggio, incluso l'utilizzo di terminologia tecnica appropriata, la capacità di esposizione.

La prova si considera superata se il voto riportato nello scritto è di almeno 18/30.

Gli studenti che abbiano riportato nella prova scritta almeno 18/30 e desiderano sostenere anche l'esame orale potranno contattare il docente per il colloquio integrativo. La data dell'esame orale sarà comunicata dal docente tramite blended.

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.