Il corso ha la finalità di fornire agli studenti le conoscenze teoriche, necessarie alla caratterizzazione biochimica ed immunologica di una proteina. Grazie all'attività pratica lo studente potrà acquisire buona padronanza delle più comuni tecniche di laboratorio a tale scopo impiegate.
E' considerato obiettivo formativo anche l'acquisizione della capacità di registrare in modo sistematico dati e procedure e di valutare criticamente i risultati sperimentali ottenuti.

1. Purificazione delle proteina d'interesse da una miscela complessa
1.1 Preparazione degli estratti cellulari da cellule procariotiche ed eucarotiche;
1.2 Cromatografie: principi, limitazioni ed applicazioni
1.3 Solubilità differenziale: salting-in e salting-out
1.4 Precipitazione isoelettrica

2. Caratterizzazione biochimica di una proteina
2.1 Elettroforesi: principi, limitazioni ed applicazioni : Elettroforesi su gel di poliacrilammide con sodio dodecilsolfato (SDS-PAGE), Elettroforesi in condizioni native, Gel in gradiente, Elettroforesi bidimensionale (2D-PAGE), Rivelazione, quantificazione/stima e recupero di una proteina da gel, Elettroeluizione
2.2 Sequenziamento automatico N-terminale
2.3 Determinazione dello stato redox di una proteina: Effetti dello stato redox sulla struttura e funzionalità di una proteina, Metodi di valutazione dei gruppi sulfidrili liberi presenti in una proteina: dosaggi spettrofotometrici e mediante utilizzo di marcatori radioattivi, Identificazione dei disolfuri presenti in una proteina.

3. Purezza di una proteina/antigene
3.1 Endotossine batteriche: TEST LAL metodiche qualitative e quantitative
3.2 Metodi per la rimozione di contaminanti endotossinici da campioni

4. Caratterizzazione immunochimica di una proteina
4.1 Produzione di anticorpi: risposta immunitaria, studio di adeguati protocolli di immunizzazione, Anticorpi policlonali e monoclonali, Anticorpi ricombinanti ingenierizzati derivanti da Phage Display
4.2 Purificazione e frammentazione di immunoglobuline
4.3 Marcatura di anticorpi: Marcatura con isotopi radioattivi, Marcatura con composti fluorescenti, Biotinilazione, Coniugazione a complessi enzimatici.
4.4 Avidità/affinità di anticorpi, concetto di anticorpo neutralizzante

5. Tecniche immunochimiche
5.1 Immunoprecipitazione
5.2 Western blotting e immunoblotting
5.3 Test ELISA semplice, sandwich, competitivo. Sviluppo di un kit diagnostico basato su tecniche ELISA
5.4 TEST ELISA IgG Isotype ed ELISPOT per la valutazione della tipologia della risposta immune Th1/Th 2
5.5 Utilizzo di anticorpi fluorescenti (cenni di citofluorimentria e immunofluorescenza)

ESERCITAZIONI DI LABORATORIO
1. Estratti cellulari in condizioni denaturanti
2. SDS-PAGE
3. Determinazione dello stato redox di una proteina
4. Test LAL metodica Gel Clot
5. Purificazione di un anticorpo policlonale
6. Biotinilazione di un anticorpo policlonale
7. Immunoprecipitazione
8. Western blotting
9. immunoblotting
10. Test ELISA
11. Preparazione di cellule per saggi in fluorescenza
12. EMSA

Modalità didattiche

Lezione frontale (3 CFU); Esercitazioni di laboratorio (5 CFU).

Obblighi

Obbligo di frequenza delle attività di laboratorio per almeno 2/3 della loro durata

Testi di studio

• K. Wilson e J. Walker "Biochimica e biologia molecolare" Raffaello Cortina Editore,
• Gregory A. Petsko Damgar Ringe "Struttura e funzione delle proteine" Zanichelli
• Daan J.A. Crommelin Robert D. Sindelar " Biotecnologie Farmaceutiche" Zanichelli
• Articoli e riferimenti specifici aggiornati indicati dal docente durante il corso

Modalità di
accertamento

Esame orale, quaderno di laboratorio (vedi note).

Disabilità e DSA

Le studentesse e gli studenti che hanno registrato la certificazione di disabilità o la certificazione di DSA presso l'Ufficio Inclusione e diritto allo studio, possono chiedere di utilizzare le mappe concettuali (per parole chiave) durante la prova di esame.

A tal fine, è necessario inviare le mappe, due settimane prima dell’appello di esame, alla o al docente del corso, che ne verificherà la coerenza con le indicazioni delle linee guida di ateneo e potrà chiederne la modifica.

Durante le esercitazioni di laboratorio gli studenti dovranno compilare individualmente un quaderno di laboratorio. Il quaderno rimane in laboratorio per tutta la durata del corso verrà riconsegnato allo studente prima dell'esame. Il quaderno è oggetto di discussione durante l'esame orale e la sua corretta compilazione, valutata dal docente, concorre assieme alla prova orale a determinare il voto finale.